Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.
Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.
Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.
Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.
Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.
С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).
Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).
Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.
Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.
Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.
В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.
Реакция агглютинации (РА)
Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.
Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).
В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.
Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.
Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.
Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.
Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.
У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.
Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.
Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.
При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.
При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.
Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.
При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).
Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.
Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.
Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)
Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.
РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.
В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.
Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).
В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.
Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.
Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).
При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.
Реакция преципитации (РП)
В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.
Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.
Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.
Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.
Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.
Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.
Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.
Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.
В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.
Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.
Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.
Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.
Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)
Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.
При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.
Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.
Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.
Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.
1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.
Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).
Реакция лизиса (РЛ)
Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.
Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.
Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.
Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.
Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.
Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.
Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.
Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.
Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.
Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».
Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.
Реакция связывания комплемента (РСК)
Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.
Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.
Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.
Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.
Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).
По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.
В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.
Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.
Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.
Реакция гемагглютинации (РГА)
В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.
В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.
В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.
В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.
Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.
Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.
Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.
Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.
В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.
Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.
Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.
Реакция иммобилизации (РИ)
Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.
Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.
Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)
В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.
Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.
К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.
Реакция преципитации
- РП (от
лат. praeci- pito
- осаждать,) - это формирование и осаж-дение комплекса растворимого молекулярно-го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк-вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.
Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита-тельных средах и др. Широкое распростране-ние получили разновидности реакции преци-питации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др
Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммун-ную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застыва-ния в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диф-фундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуног-лобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет-ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела кото-рой, диффундируя в гель, образуют в месте — встречи» с антигеном линии преципитации.
Иммунная электронная микроскопия - элек-тронная микроскопия микробов, чаще ви-русов, обработанных соответствующими ан-тителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра-зуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.
123. Реакция преципитации в геле для определения токсигенности микроорганизмов, механизм, методы постановки.
Реакция преципитации (РП) — это формирова-ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количес-твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой - антиген - наслаивается на первый в виде раствора.
Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций.
Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1%-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки, 4-5 - по окружности на расстоянии 1-2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические - раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре.
Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со-здаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных.
Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения.
Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.
Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита.
Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли-чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.
Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час-тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте-риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению.
В РП используются жидкие прозрачные Аг.
Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.
Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг.
Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль-но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот-кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля-ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг.
Она нашла также применение в су-дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль-сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не-достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро-вании преципитата.
Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля.
В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто-янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы.
При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере-крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ.
Широко используется для диагностики заболева-ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.
3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару-жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч-ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай-шим микроорганизмам.
РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ.
Реакция преципитации.
Для этого эритроциты обрабаты-вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей.
Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро-цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.
Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу-говицы»
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Реакция кольцепреципитации
Реакция кольцеприцепитации – одна из наиболее простых серологических методов. Она выполняется в узких преципитационных пробирках. Сначала во все пробирки поровну разливают прозрачный раствор антигена, взятого в нескольких разведениях (1:2; 1:4; 1:8; 1:16).
Соединение антигенов и антител происходит на границе соприкосновения реагентов. В результате этого взаимодействия в положительных случаях (когда антиген соответствует антителу) через некоторое время происходит образование преципитата в виде опалесцирующего кольца.
Реакция нашла широкое применение в медицинской практике для выявления в шерсти, шкурах, мясе животных сибиреязвенного антигена (реакция Асколи); для обнаружения других возбудителей инфекционных болезней в патологическом материале, полученном от больных, или в объектах внешней среды, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка в частности, белка крови или других биологических жидкостей.
Иммунодиффузия по Оухтерлони
Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле.
Метод основан на том, что частицы антигенов и антител из-за различных размеров диффундируют в геле с неодинаковой скоростью и вследствие этого продвигаются на разные расстояния. Это позволяет разделить отдельные системы антигенов в тех случаях, когда они находятся в смеси, и, следовательно, дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белковых веществ, сывороток и тканей животных.
Наглядный и эффективный метод преципитации в геле предложил Оухтерлони.
На чашках Петри с агаром делают небольшие лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. В один из них наливают антиген, в другие — сыворотки. Компоненты реакции диффундируют в геле по направлению друг к другу и образуют видимую линию преципитации там, где антигены встречаются с оптимальными концентрациями специфических для него антител. Поскольку реагенты диффундируют из лунок концентрически, можно провести сразу несколько исследований, если разместить вокруг лунки с антителами несколько лунок с разными антигенами (или с разными разведениями одного и того же антигена).
Реакция Оухтерлони дает возможность делать заключение о природе антигена по известной сыворотке и, наоборот, по известному антигену определяется природа антител.
Преимущество метода – в том, что он позволяет сравнить антигенные компоненты сложных смесей и судить об их общности или различиях. Для сравнения общности антигенов готовят агар с лунками: в одну наливают антисыворотку, в другие – сравниваемые антигены. Если антигены различны, то полосы преципитации располагаются неодинаково.
Иммуноэлектрофорез
В последние годы для тонких иммунологических исследований применяется метод иммуноэлектрофореза. Метод впервые описали П.
Грабар и К. А. Уильямс в 1953 г. Он представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле на стеклянных пластинках с иммунодиффузией. В начале проводится электрофоретическое разделение антигена, зачастую представляющего собой смесь белковых или других молекул. Для этого антиген вносят в заранее вырезанную в агаре лунку, и пластинку с агаром на некоторое время помещают в зону постоянного электрического тока.
Из-за разной скорости движения молекул происходит разделение антигена на составляющие части. После этого в канавку, вырезанную в направлении, параллельном движению тока, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу.
Преципитация
Каждый антиген дает зону преципитации в виде дуги с соответствующими для него антителами. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигена.
Реакция флоккуляции
Метод предложен Рамоном в 1924 году.
Он основан на том, что смесь токсина с антитоксической сывороткой в определенных условиях дает помутнение и выпадение осадка. При этом реакция наступает раньше в тех пробирках, где количество антитоксина соответствует дозе, полностью нейтрализующей данное количество токсина.
Следовательно, если известна сила токсина, то можно установить количество антитоксина в неизвестной испытуемой сыворотке. Для этого готовят несколько разведений исследуемой сыворотки, добавляют к каждому разведению одинаковые количества известного токсина, после чего наблюдают, в какой из пробирок раньше всего наступит флоккуляция (помутнение раствора). Определяют инициальную флоккуляцию. Затем производиться расчет.
Например, требуется определить концентрацию противодифтерийных антител в исследуемой сыворотке. В реакции применяется дифтерийный токсин, содержащий 50 Lf в 1 мл (Lf – это минимальное количество токсина, которое нейтрализуется 1 антитоксической единицей (АЕ) антисыворотки.
Допустим, что инициальная флоккуляция отмечена в пробирке, где находилось 0,2 мл этой сыворотки и 2 мл известного токсина активностью 100 Lf (50 Lf х 2).
Значит, 0,2 мл сыворотки нейтрализовали этот токсин. Следовательно, 0,2 мл сыворотки содержат 100АЕ, а в 1 мл этой сыворотки концентрация антител соответствует 500 АЕ (100 АЕ х 5).
Аналогичным методом реакцию флоккуляции можно применять и с противоположной целью – для определения иммунизирующих свойств анатоксинов.
Для этого необходима стандартная антитоксическая сыворотка.
Реакция нейтрализации
Реакция применяется при диагностике пищевых бактериальных отравлениях для определения в исследуемом материале бактериальных токсинов. Кроме того, ее можно ставить при исследовании некоторых объектов внешней среды на содержание патогенных бактерий, продуцирующих токсины, например, при исследовании почвы на наличие возбудителей столбняка или газовой гангрены.
Известно, что токсин в смеси с гомологической антитоксической сывороткой не проявляет своего токсического действия, так как токсин нейтрализуется. Реакция взаимодействия токсина с антитоксином, как правило, строго специфична, поэтому для постановки реакции нейтрализации с целью определения типа токсина необходимо иметь диагностические сыворотки, специфические к каждому виду и типу токсина. Можно применять одновременно применять смесь 2-3 антитоксических сывороток и более, если предполагается наличие в исследуемом материале несколько токсинов.
Реакция нейтрализации позволяет определить вид и тип токсина возбудителя.
Исследуемым материалом может быть фильтрат пищевых продуктов, предположительно вызвавших отравление, смывы с посуды, где находились эти продукты и др.
Предварительно проводится нейтрализация предполагаемого токсина. Для этого в пробирку с исследуемым материалом (опытная пробирка) добавляется антитоксическая диагностическая сыворотка (она содержит антитела к искомому токсину); в другую пробирку (контрольную) доливается равный объем физиологического раствора.
После кратковременной инкубации содержимое пробирок вводится двум группам белых мышей (опытной и контрольной).
Результаты реакции нейтрализации учитывают сразу же после гибели контрольных животных. В таком случае факт выживания животных, получивших антитоксическую сыворотку вместе с исследуемым материалом, указывает на наличие в нем токсина, соответствующего вводимой сыворотке.
Достоинством реакции нейтрализации является высокая достоверность получаемых результатов.
Однако по своей чувствительности и быстроте получения ответа она уступает некоторым другим методам исследования.
Реакции лизиса
Реакциями лизиса принято называть растворение корпускулярных антигенов под действием антител, специфичных в отношении данного антигена, в присутствии комплемента.
Из иммунных реакций, основанных на феномене лизиса бактерий и других корпускулярных антигенов, применяются, главным образом, реакции бактериолиза и гемолиза.
Реакция бактериолиза
Реакция происходит как in vitro, так и in vivo. Последняя известна под названием реакции В.И. Исаева – Пфейффера.
Этими учеными показано, что если морских свинок предварительно проиммунизировать холерными антигенами, то последующее введение им в брюшную полость высоковирулентной культуры холерного вибриона не вызывает заражения животных, так как в брюшной полости происходит растворение возбудителя под воздействием специфических антител.
В дальнейшем И.
И. Мечников доказал, что аналогичное растворение холерного вибриона под воздействием иммунной сыворотки происходит и в пробирке, если к основным компонентам добавить свежую сыворотку — источник компле-мента. Растворение бактерий под действием специфических антител в присутствии комплемента получило название реакции бактериолиза.
При постановке реакции бактериолиза сначала готовят ряд 10-кратных разведений исследуемой сыворотки. Затем в каждуюпробирку добавляют одинаковое количество (по 1-2 капли)микробной взвеси. К смеси добавляют комплемент. После инкубирования при 37 °С из каждой пробирки делается высев смеси на питательную среду для установления наличия или отсутствия жизнеспособных бактерий.
Реакцию можно применять для определения антител с помощью известного микроорганизма или для определения вида микробов с помощью диагностической иммунной сыворотки.
В практической работе бак-териологов эта реакция применяется редко, главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.
Реакция гемолиза
Механизм гемолиза аналогичен механизму бактериолиза.
Испо-льзуемые в реакции эритроциты являются антигеном. Источником ан-тител является антиэритроцитарная сыворотка (например, если в реакции применяются бараньи эритроциты, то необходимую сыворотку со специфическими антиэритроцитарными антителами получают от кро-ликов, иммунизированных бараньими эритроцитами).
В качестве комплемента в реакциях лизиса чаще всего используется сыворотка крови морской свинки, так как в ней содержится значительно больше комплемента, чем в сыворотках других животных.
В тех случаях, когда антитела в присутствии комплемента разрушают эритроциты, из них выходит гемоглобин, и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов превращается в прозрачную красную жидкость (лаковая кровь).
Такую реакцию называют гемолизом. В лабораторной практике она применяется в качестве пока-зателя адсорбции комплемента в реакции связывания комплемента.
Похожая информация:
Поиск на сайте:
План лекции: Предмет и краткая история развития микробиологии. Общие свойства микроорганизмов и их положение в природе.
преципитации реакция
Ветеринарная микробиология и ее задачи
mir.zavantag.com > Биология > Лекция
1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15
| ^
РА впервые разработана М.Грубером в 1896 г. Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит склеивание (агглютинация) микробов с образованием хлопьев, комочков, видимых невооруженным глазом. РА широко применяется для серологической диагностики многих бактериальных инфекций (бруцеллеза, сапа, сальмонеллезов, колибактериоза и др.) и для серологической идентификации видов и типов выделенных микроорганизмов. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, реакция гемагглютинации и ее варианты (РЗГА, РНГА), антиглобулиновый тест Кумбса и др. ^ – вместо сыворотки берется кровь. Ставят пластинчатую реакцию. Диагностируют пуллороз кур и индеек, микоплазмоз кур. Реакция Кумбс�� позволяет выявить неполные антитела. Последние одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината. Метод основан на применении антиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). ^ – она не относится к серологическим и диагностически точным реакциям, однако позволяет обнаружить антиген – гемагглютинин и установить гемагглютинирующие свойства (способность агглютинировать эритроциты) у некоторых бактерий и микоплазм. РНГА – в последние годы заняла одно из ведущих мест в серодинамике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя или антитела предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитов барана или др. животного. Затем ставят реакцию путем смешивания сенсибилизированных эритроцитов с сыворотками крови больных животных или во втором случае с исследуемым антигеном. При наличии в сыворотке спец. Антител на данный антиген (или наоборот) происходит агглютинация эритроцитов – реакция положительная. Предложена Р.Краусом в 1897 году. Преципитация – явление, наблюдающееся при взаимодействии антител-преципитинов и антигена-преципитиногена. Сущность реакции заключается в изменении дисперсности коллоидов антигена и их осаждением под влиянием специфических антител, находящихся в иммунной сыворотке. РП может быть поставлена в пробирках в жидкой среде (реакция кольцеприципитации) или в агаровом геле (пластинчатая РДП). Реакция кольцеприципитации впервые предложена Асколи (1910), наиболее широко ее применяют в целях диагностики сибирской язвы. При проведении ветеринарной экспертизы РП является методом определения фальсификации мясных, мучных и др. продуктов. Особое значение эта реакция имеет в судебно-медицинской экспертизе при определении видовой принадлежности крови. Применение реакции преципитации в жидкой среде не позволяет, однако, охарактеризовать гетерогенность антигенов, т.е. количество и концентрацию антигенов в препарате. Данные сведения можно получить, если поставить РП в геле (чаще агаровом). Обладая скоростью передвижения, различные антигены препарата неодинаково диффундируют, образуя в толще прозрачного геля не месте встречи с гомологичным антителом преципитаты. Локализация и концентрация линий преципитинов будут характерны для каждого компонента антигенного препарата, что служит критерием его качества. Путем разведения препарата можно характеризовать относительное содержание в нем антигенов. Разработано несколько методов постановки РДП: метод прямой одномерной диффузии по Удену (1946), метод простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (1963), метод двойной диффузии в агаровый гель по Оухтерлони (1948) и др. ^
(РН) на модели столбнячных токсинов и антитоксинов. Сущность РН заключается в способности гомологичных антител иммунной сыворотки подавлять (нейтрализовать) инфекционные свойства возбудителя болезни или продуктов его жизнедеятельности. Для установления результата реакции смесью антиген-антитело заражают лабораторных животных, КК, КЭ. Показатель положительно РН – отсутствие гибели биологических тест-систем. В бактериальной практике РН применяют при диагностике анаэробной энтеротоксемии, ботулизма и др. РН проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов. Используют для выявления антител в сыворотке крови и для обнаружения в исследуемом материале антигена (при бруцеллезе, сапе, риккетсиозах, туберкулезе и др.). Данная реакция относится к непрямой двухсистемной. В ней участвуют 5 компонентов:
Компоненты 3,4,5 составляют индикаторную систему. Если антиген и антитело испытуемой сыворотки соответствуют друг другу, возникает иммунный комплекс антиген-антитело, который связывает и извлекает из среды, где протекает реакция, комплемент. При отсутствии в испытуемой сыворотке антител, соответственных антигену, указанный комплекс не образуется – комплемент остается свободным. Поскольку это невидимые процессы, то для решения вопроса, что же произошло с комплементом, в пробирку в качестве индикатора вводят компоненты гемолитической системы – гемолитическую сыворотку + эритроциты. Если в бактериологической системе комплемент связался – гемолиз эритроцитов не произойдет, результат положительный – в сыворотке содержатся антитела. Наличие гемолиза служит показателем наличия свободного комплемента в бактериологической системе, что возможно только при отсутствии в испытуемой сыворотке антител – результат отрицательный. РСК протекает при строгих количественных соотношениях компонентов. Это достигается их предварительным титрованием (комплемент и гемолитическую сыворотку титруют в день постановки реакции; микробный антиген – один раз в течение 2-3 месяцев). Титрование – определение наименьшего количества того или иного компонента в реакции для проведения реакции, лишнее или недостаток – искажение результатов. РДСК – это вариант РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16-18 часов на холоде (40С), что повышает чувствительность из-за более длительной адсорбции комплемента комплексом антиген-антитело. |
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Схожі:
| Определение понятия «экологическая микробиология» Общей микробиологии, изучающий взаимоотношения микроорганизмов между собой, с объектами внешней среды и макроорганизмом |
Наиболее общие и фундаментальные понятия, отражающие существенные,… Философия -наука, к-рая изучает самые общие положения о человеке, природе и о познании |
||
| План Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения»… Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения» и история развития мэо |
Вопросы к экзамену по курсу «юридическая психология» Для студентов… Понятие о юридической психологии. Предмет, задачи и история развития юридической психологии |
||
| 1. Предмет и метод истории политических и правовых учений > Предмет… Это обусловлено тем, что в рамках данной юридической дисциплины исследуется и освещается специфический предмет – история возникновения… |
1.
История философии как наука. Её предмет и метод |
||
| Министерство образования и науки республики казахстан альянс студентов… Настоящее положение о республиканском конкурсе «Студент Года- 2011» (далее по контексту конкурс) определяет его цели и задачи, участников… |
Определение терминов «микробиология» и«микроорганизм» … |
||
| Вопросы для подготовки к зачету по дисциплине «конфликтология» Конфликтология как наука: предмет, цели, задачи, актуальные проблемы, значение на современном этапе развития общества |
О краевом конкурсе видео-роликов «к-роли-к!» Общие положения Настоящее Положение определяет цели, задачи, принципы Конкурса, порядок его организации и проведения, порядок участия и определения… |
Додайте кнопку на своєму сайті:
Школьные материалы
mir.zavantag.com
Реакция преципитации
Преципитация и агглютинация - это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ.
В первом случае он представлен в растворимой, во втором - в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ-АТ. РП высоко специфична и чувствительна.
Ингредиенты реакции:
1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);
2. АТ - преципитины {иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими растворами АГ-ми);
Реакция преципитации
изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.
Методы постановки РП:
1) РП в растворах - р.
кольцепреципитации;
2) РП в геле.
Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки.
Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации.Примером такого способа постановки РП является реакция термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильного гаптена возбудителя сибирской язвы, извлекаемый из органов животных, кожи, шерсти экстракцией при кипячении.Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки.
В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.Реакция преципитации в геле носит название иммунодиф-фузии.
Часто форезом в геле - иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофорети-чески. полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.
Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген - гаптен B.
Antrachis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена.
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры В. ап1Ьгас!3, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Просрильтровать через асбестную эату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген- Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут.
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ.
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
Реакция преципитации основана на образовании преципитата - осаждении иммунных комплексов антиген-антитело. В растворах они выпадают в осадок, а в гелях откладываются в виде полос. Для определения концентрации антител в исследуемом материале используют очищенные антигены, при этом существует несколько способов проведения реакции преципитации.
Преципитация в растворе
Реакция преципитации в растворах имеет особенность: количество преципитата зависит от количества реагента (антител). Если количество антител меньше количества антигена, то увеличение количества последних приводит к большему образованию преципитата. Наибольшее количество преципитата образуется при относительно равном количестве антигенов и антител. Если антиген находится в избыточном количестве по сравнению с антителами, то при увеличении его концентрации количество преципитата уменьшается.Иммунодиффузия
Наиболее распространенный способ проведения реакций преципитации связан с иммунодиффузией - способностью антител и антигенов проникать в гель.Для простой радиальной иммунодиффузии используют гель, в состав которого включены антитела. В тонком слое геля делают круглые прорези и помещают в них исследуемый материал с антигенами, которые проникают вглубь геля, взаимодействуют с антителами и образуют вокруг лунок кольца преципитата. Таким способом определяют содержание иммуноглобулинов в крови.
Многие реагенты для биохимических анализов выпускают зафиксированными на планшетках. В каждой ячейке планшетки содержится строго отмеренное количество реагента, поэтому можно проводить сразу множество анализов с высокой точностью результатов.
При двойной радиальной иммунодиффузии в тонком слое геля на определенном расстоянии друг от друга вырезают два круглых отверстия. В одно помещают реагент, а в другое - исследуемый материал. Антитела и антигены проникают в гель навстречу друг другу. В месте их взаимодействия образуется преципитат.
Для определения концентрации антигена в исследуемом материале измеряют расстояние от лунки с ним до линии преципитата.
Преципитации реакция преципитации реакция
реакция взаимодействия in vitro антигена с антителом, приводящая к видимому невооруженным глазом помутнению среды или образованию осадка иммунного комплекса (преципитата). Применяется для идентификации антигенов и антител, контроля чистоты антигена, количественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Дляпостановки П. р. необходимы прозрачные растворы антигена и соответствующей сыворотки.
(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)
Преципитации реакцияпробирочная реакция взаимодействия Ат с Аг в жидкой фазе или в геле, к-рая приводит к образованию видимых невооруженным глазом иммунных преципитатов (помутнения). Применяют для идентификации Аг и Ат, контроля чистоты Аг, количественного содержания Ат и Аг. Для постановки П. р. необходимы прозрачный р-р Аг, антисыворотка, физраствор или гель (1,5 - 2% агаровый и агарозный в вероналацетатном буфере, рН 6,8, ионная сила - 0,1). Чаще используют следующие методики: 1) реакцию колъцепреципитации. В преципитационную пробирку (пробирки) наливают по 0,2 мл преципитирующей с-ки с высоким титром и на нее осторожно наслаивают примерно такое же количество р-ра Аг (цельного или разведенного). В положительном случае через несколько минут на границе реагентов образуется подвижное кольцо белого цвета. Обязательны контроли Аг, с-ки, заведомо положительный, заведомо отрицательный и др. Применяют для идентификации Аг в экстрактах из различных материалов, в т.ч. инфекц.; 2) двойную радиальную иммунодиффузию по Оухтерлони. В равномерном слое 1% агарового геля толщиной около 1,5 мм пробивают лунки на расстоянии 4-10 мм и заполняют их р-рами антисыворотки и Аг. Результат учитывают через сутки (до 6 - 7 сут) инкубации при 4°, 20° и 37°С на влажном или высушенном и окрашенном препарате по числу и расположению линий преципитации. У однокомпонентных систем между лунками с Аг и Ат появляется одна линия, у многокомпонентных -несколько линий, при идентичных Аг линии сливаются, при неидентичных- пересекаются. Используют для качественного анализа, определения чистоты препаратов, идентификации Ат и Аг; 3) простую линейную иммунодиффузию по Удену. Применяют с теми же целями, что и двойную. Содержащий антисыворотку гель разливают по пробиркам или трубочкам. На гель в пробирках наливают р-р Аг, а трубочки помещают в стаканчик с р-ром Аг. Результаты учитывают после выдерживания системы при +4°С в течение 48 ч по наличию преципитата и фронта, к-рый прошел Аг. По формуле находят количество Аг; 4) простую радиальную иммунодиффузию по Манчини. Гель с моноспецифической с-кой ровным слоем наливают на стеклянную поверхность. После застывания в геле пробивают лунки и заливают в них р-ры иссл. Аг. Систему выдерживают 40 ч при +4° или 20°С. В положительных случаях вокруг лунки образуется преципитат, площадь к-рого отражает количество Аг. Аналогичным образом ставят контроль с серией разведении стандартного Аг. Измеряют диаметр зоны преципитата, высчитывают площадь и по калибровочной кривой находят количество Аг в 1 мл субстрата.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
Смотреть что такое "преципитации реакция" в других словарях:
реакция преципитации - — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN precipitation reaction … Справочник технического переводчика
- (RW или ЭДС Экспресс Диагностика Сифилиса) устаревший метод диагностики сифилиса. В настоящее время заменён микрореакцией преципитации (антикардиолипиновый тест, MP, RPR Rapid Plasma Reagin). Названа по имени немецкого иммунолога Августа… … Википедия
реакция преципитации - rus реакция (ж) преципитации eng precipitin test, precipitation test fra réaction (f) de précipitation (f) deu Präzipitintest (m), Präzipitations Reaktion (f) spa reacción (f) de precipitación, reacción (f) de precipitinas, prueba (f) de… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки
Метод обнаружения и идентификации антител или растворимых антигенов, основанный на феномене преципитации … Большой медицинский словарь
Преципитация (лат. praecipitatio стремительное падение) В химии и биохимии синоним слова осаждение В иммунологии иммунологическая реакция осаждения из раствора нерастворимого комплекса антиген антитело, образующегося в результате соединения… … Википедия
Метод обнаружения малых концентраций антител, моновалентных гаптенов или поливалентных антигенов, основанный на торможении в их присутствии реакций преципитации, агглютинации или связывания комплемента вследствие специфического блокирования… … Большой медицинский словарь
Модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами антигена и антител … Большой медицинский словарь
Тест на наличие сифилиса, в котором определение характерных для этого заболевания антител в крови обследуемого производится с помощью реакции преципитации. Данный тест является менее доступным, чем некоторые другие.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ, РПГ
(Gel precipitation test)
Метод выявления антигенов и антител, основанный на диффузии компонентов через слой агарового (агарозного) геля и образования видимого преципитата на участках, где создаются их эквивалентные концентрации.
Чаще всего используется метод двойной (встречной) диффузии, предложенный О. Ухтерлони в 1948 г., при котором антигены и сыворотки вносятся в противостоящие лунки, вырезанные в пластинке геля; через определенное время в толще геля образуются преципитационные полосы, соответственно числу антигенов и антител совпадающей специфичности. Кроме того, метод позволяет проводить сравнение нескольких антигенов между собой при некой стандартной сыворотке: в случае их идентичности образуемые ими полосы преципитации сливаются в сплошную линию и, наоборот, полосы пересекаются, если сравниваемые антигены имеют различия (т. н. феномен “шпоры”). Другим преимуществом РПГ является то, что смеси антигенов могут разделяться за счет разной скорости диффузии и выявляться индивидуально; по этой же причине могут отделяться и ингибиторы преципитации, если они содержатся в испытуемом материале. Недостатком метода считают его низкую чувствительность, иначе, разрешающую способность. РПГ широко использовалась как тест на обнаружение антигенов вируса гепатита В и антител к ним в 60 - 70-е годы, в частности, с помощью этой реакции было установлено наличие в составе вируса е-антигена или