Эта статья будет посвящена явлению реакции преципитации. Здесь мы рассмотрим особенности постановки данного явления, явление диффузии, общую характеристику, роль в жизни человека и многое другое.
Ознакомление с явлением
Преципитация - это явление серологического типа, в ходе которого происходит взаимодействие растворимых антигенов с антителами и вследствие этого наблюдается выпадение осадка - преципитата.
Общая характеристика реакции преципитации представляет собой форму согласованного влияния антигена и антитела. Такие типы взаимодействия позволяют определять наличие неизвестных антигенов в исследуемом веществе при помощи добавления известных антител и антигенов. Процесс преципитации без присутствия солей будет протекать хуже, а наилучший оптимум лежит в пределах диапазона от 7,0-7,4 pH.
Составные элементы реакции
Среди компонентов реакции преципитации выделяют три главных элемента:
- Антиген, обладающий природой молекулярного характера. Он находится в состоянии мелкодисперсного типа, другими словами, он растворим. А также такой антиген называют преципитогеном, который является лизатом или экстрактом ткани и др. Преципитоген имеет характерное отличие от агглютиногена, которое заключено в размере частиц, из которых он состоит. Агглютиногену присущий размер клеток, а преципитогены соизмеряются с величиной молекулы. Раствор антигена характеризуется прозрачностью.
- Антитело, находящееся в сыворотке человеческой крови, а также в иммунной диагностической сыворотке, которая содержит в себе изученные антитела.
- Электролиты - это раствор хлорид натрия, которому свойственно изотоническое состояние.
Получение преципитогена
Постановка реакции преципитации невозможна без преципитогена, который получают при помощи измельчения материалов и извлекания из них антигенов белковой природы. Добывание происходит при помощи кипячения или других способов.
Ярким примером преципитогенов служат лизаты, а также тканевые и органные экстракты, сыворотки крови, разнообразные виды фильтратов, базирующихся на бульонных культурах из микробов, а также солевой экстракт микроорганизмов и аутолизатные вещества.
Постановка в преципитации
Теперь рассмотрим способ постановки реакции преципитации.
Производится кольцепреципитационная реакция, которая протекает в специально подготовленных пробирках. В полость посуды вносят сыворотку, разливая ее по стене при помощи носика пипетки. Далее, сверху аккуратно производят наслаивание соответствующего количества преципитогена, а потом пробирку приводят в вертикальное положение из горизонтального. Постановка и учет реакции преципитации - это весьма скрупулезные операции. Учет результата проводится после появления белого колечка на границе между антигеном и антителом. Если реагирующие элементы реакции соответствуют друг другу, то они связываются, но это становится заметным после продолжительного промежутка времени их взаимодействия.
Реакцию преципитации проводят также в чашке Петри или на предметном стекле, куда переносят агаровый гель, нанося его небольшим слоем. После его застывания в геле вырезают небольшое количество лунок, в которые будут помещены антигены и антитела. Существует два способа совершения подобного действия: метод радиальной иммунодиффузии и двойной иммунодиффузии.
Общие сведения
Механика работы преципитации схожа с устройством агглютинации. Подвергаясь влиянию сыворотки иммунного типа, антиген, уже вступивший в реагирование, уменьшает свою Важным условием является прозрачность как сыворотки, так и антигена.
Улучшить регистрацию реакции можно в том случае, если производить наслаивание антигенов на антитела. Вследствие этого можно наблюдать появление преципитатов в форме кольца. Это явление называется кольцепреципитацией и проводится в особых пробирках, имеющих диаметр от 2,5 до 3,5 мм. Одним из самых широко распространенных примеров реакции преципитации может служить диагностирование сибирской язвы.
Преципитация дает возможность определять уровень токсигенности дифтерийной культуры в агаре.
В ходе рассматриваемой реакции происходит осаждение антигенных комплексов и антител. Преципитация является иммунологическим феноменом, позволяющим определять количество содержания антител в сыворотках крови больного или вакцинированного человека и животных.
Следствие титрования
Важно знать, что данные, полученные путем титрования вышеупомянутого метода, не обладают количественным выражением. Чтобы создать и проанализировать количественную оценку содержащегося числа антител, была разработана М. Гейдельбергером и Е. Кабатом специальная методика реакции, в основе которой залегает поиск и выявление зоны эквивалентности. Смешивание возрастного числа антигенов с постоянной величиной объема антисыворотки приводит к возрастанию первоначально образующегося преципитата, а далее снова происходит его снижение вследствие увеличения способности к растворению комплексов антигена. Определив количество антител в надосадочных жидкостях, содержащихся в каждой пробирке, можно обнаружить, что в определенном числе посуды с антителами жидкость будет отсутствовать. Здесь будет образован, в сравнение с другими пробирками, самый большой преципитат. Благодаря этому и вычитанию из общей величины белков антигенного белкового преципитата, можно получить точную величину содержащихся антител в объеме конкретно исследуемой сыворотки. Далее, количество белковых молекул преципитата определяется по количеству азота или при помощи колориметрических методов.
Оценка значений
Оценка значений преципитации в диагностической методологии, должна учитывать вероятность наличия в иммунной сыворотке антитела, не обладающего свойством преципитина, из чего следует, что сам преципитат может не образоваться после реагирования с антигенами. В список таких молекул входят неполные антитела и некоторые виды из группы гамма-А-глобулинов.
Реакция преципитации в условиях лабораторий находит свое применение в разнообразных видах модификаций. Например, реакция термопреципитации применяется для выявления бактериальных антигенов ботулизма, сибирских язв и т. д., не подвергающихся денатурации термического типа. В отличие от кольцепреципитации, подобный тип реакции использует фильтраты рассматриваемого материала в прокипяченном состоянии.
преципитации в сложной смеси не позволяет давать характеристику свойствам отдельных элементов смеси. В таких случаях человек прибегает к методу преципитации в агаре, а также используют иммуноэлектроферез.
Преципитация диффузного характера
В данной области исследований существует понятие о реакции диффузной преципитации (РПД). Она основывается на способностях к диффузии в геле антител и растворяемых антигенов. Диффузия - это умение молекулы определенного вещества проникать в молекулы другого, что обуславливается тепловым движением.
Гель - это система дисперсного типа, в которой жидкостная фаза распределяется равномерным образом в твердой фазе. Чаще всего для такой реакции эксплуатируют гель агара.
После придания параметров, в условии которых молекулы смогут диффундировать по отношению друг к другу, их встреча будет сопровождаться образованием комплекса антигена + антитело. Такое новообразование способно диффундировать, находясь в самом геле, и оно будет выпадать в осадок, принимая вид полосы, которую можно обнаружить невооруженными глазами. В случае гомологичности антигена и антитела, полоса образовываться не будет.
Создание условий, в которых будет проходить диффузия, находясь в агаровом слое, предусматривает собой заливку компонентов, а вот общее число лунок и их взаиморасположение определяется типом задачи, которую необходимо решить. РПД дает человеку возможность обнаруживать и идентифицировать неизвестные выделенные вирусы при помощи исследования, с использованием заведомо известной сыворотки из антител.
Применение
Преципитация широко используется не только в диагностике заболеваний, но и находит свое применение в судебно-медицинской экспертизе. Сложно представить анализ, при котором можно определить видовую принадлежность крови, части органа или ткани, найденного на орудии преступления, в котором не используется реакция преципитации. В ходе данного процесса используют преципитирующие сыворотки, которые получают путем иммунизации различных животных и птиц. Важно, чтобы уровень титра в сыворотке был не меньше 1:10000, а также он должен обладать достаточной специфичностью. Из обнаруженного пятнышка крови или ее корочки изготавливают вытяжку на физ. растворе, которая в дальнейшем будет подвержена воздействию преципитирующей сыворотки. По данной реакции можно устанавливать виды тканевых и органных белков как человека, так и животного. Получение мутных вытяжек вынуждает прибегать к преципитации на агаре.
Выводы
Анализируя прочитанную информацию, можно заключить, что реакции преципитации крайне важны для человека, так как позволяют диагностировать различные антигены при помощи антител, также данное явление широко применяется в судебно-медицинской экспертизе и позволяет идентифицировать тип крови, ткани или органа по отношению к конкретному субъекту. Существует несколько видов и способов преципитации, которые используются в соответствии с возникающими потребностями решаемой задачи.
Такие реакции используются для так называемых высокодисперсных антигенов, представляющих собой отдельные молекулы. Основные отличия их от реакций агглютинации заключаются в более медленном (как правило) образовании осадка (преципитата), меньшей его плотности и способности со временем диссоциировать.
Наиболее быстрый вариант (экспресс-метод) преципитации - это реакция кольцепреципитации. Для ее постановки используют специальные узкие пробирки, обычно называемые преципитационными. Небольшой диаметр таких пробирок должен препятствовать смешиванию двух растворов, содержащих соответственно антиген и антитела. Необходимо, чтобы оба раствора были прозрачны и не содержали видимых взвешенных частиц. Сначала в пробирку до половины объема наливают один из растворов, а затем медленно по стенке, не допуская перемешивания с уже налитым раствором, приливают второй в таком же объеме. В результате диффузии молекул антигена и антител будут создаваться меняющиеся соотношения концентраций, и, когда они окажутся эквивалентными, образуется располагающийся на границе двух растворов осадок, обычно имеющий форму кольца, что и дало название реакции. Обычно кольцо образуется в течение 5-15 мин, но затем из-за продолжающейся диффузии концентрации выйдут из зоны эквивалентности, комплексы антиген- антитело начнут диссоциировать и кольцо осадка может исчезнуть. Поэтому учитывать результат такой реакции следует не позже, чем через час после ее постановки, что в целом считается одним из ее недостатков.
С целью избежать диссоциации образующихся осадков были разработаны варианты реакций преципитации в гелях, получившие название реакций иммунодиффузии. Используемые для таких реакций гели чаще всего готовят из агара или агарозы в концентрациях от 1 % до 2 % на веронал-ацетатном буфере с рН 6,8 и ионной силой 0,1. Нагретый гелеобразующий раствор наносят слоем равной толщины на прозрачную стеклянную или пластиковую пластинку или дно чашки Петри и после застывания в геле изготавливают лунки равной глубины и диаметра. В зависимости от варианта реакции в лунки будут вноситься растворы антигенов или антител, при диффузии которых в геле будут создаваться эквивалентные концентрации. Хотя такая диффузия будет происходить медленнее, чем в жидкостях, что удлиняет время протекания реакций, образующиеся в геле осадки сохраняются гораздо большее время. Кроме того, можно улучшить визуализацию результатов проведенной реакции путем обработки гелей раствором связывающихся с белками красителей (например, Кумасси синего).
Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций является двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, расположенные на расстояниях 4-10 мм друг от друга, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и антитела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммунодиффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу. Результаты учитывают каждые 24 часа в течение 6-7 суток. Время образования преципитатов варьирует в зависимости от температуры инкубирования гелей (реакцию можно проводить при +4°С, +18-20°С или +37°С) и от молекулярной массы антигенов.
Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным.
Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини (ил. 48). Для постановки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое образуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими второй компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компонент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в силу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «радиальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки. При этом площадь занятой преципитатом ок
ружности, определяемая по формуле Б = пё , пропорциональна количеству диффундирующего компонента. Измеряя диаметр образованных преципитатом окружностей вокруг каждой из лунок и соотнося полученные величины с построенным заранее по результатам специально проведенного эксперимента графиком соотношения квадрата диаметра и известных концентраций одного из компонентов реакции (калибровочным графиком), можно точно определить концентрацию его в анализируемом растворе. Следует помнить, что условия проведения опытных реакций и реакций, дающих данные для построения калибровочного графика, должны быть полностью идентичными. Только в этом случае полученные в опыте данные можно считать достоверными. Наиболее часто используемыми температурами для проведения такой иммунодиффузии являются +4°С или +18-20°С, время учета результатов - 40-48 часов.
Определенными недостатками преципитации в гелях являются длительность проведения реакций и нечеткость результатов при невысоких концентрациях антигенов. С целью преодолеть эти недостатки во второй половине ХХ века были разработаны методы, сочетающие белковый электрофорез и иммунопреципитацию, которые получили общее название иммуноэлектрофорез (ил. 49). Помимо выигрыша во времени и повышения разрешающей способности такие методы дают возможность более четко отличить белковые антигены, имеющие одинаковые антигенные детерминанты, но отличающиеся по молекулярной массе. Для этого достаточно так называемого обычного иммуноэлектрофореза. Для его постановки изготавливают гель, в котором помимо обычных стартовых лунок готовят также желобок для сыворотки. Желобок располагают между дорожками в направлении от электрода к электроду, т. е. вдоль фронта движения белков. Гель из желобка не удаляют, чтобы не нарушать прохождение электрического тока во время фореза. Сначала в соответствующем буферном растворе проводят электрофорез образцов, анализируемых на присутствие искомого антигена. После снятия электрического поля пластинку геля переносят во влажную камеру, из желобка удаляют гель и вместо него вносят сыворотку или суспензию моноклональных антител. Результаты учитывают после инкубирования геля во влажной камере в течение 12-24 часов. В случае соответствия антигенов и антител в зоне между желобком и дорожками образуются преципитаты в виде дуг, вогнутой стороной направленных в сторону места расположения антигена. Для лучшей визуализации гель прокрашивают красителем, связывающимся с белком. Фактически такой метод является вариантом двойной иммунодиффузии, но имеет большую разрешающую способность и дает существенный выигрыш во времени.
Для некоторых белковых антигенов возможно применить вариант иммуноэлектрофореза, еще в несколько раз ускоряющий процесс. Это так называемый встречный электофорез (электросинерез). Метод основан на том, что различающиеся по аминокислотному составу белки в щелочной среде могут приобретать противоположные заряды и мигрировать при электорофорезе навстречу друг другу. Для проведения такого фореза используют буфер с рН 8,0, а в геле готовят лунки у противоположных концов (у катода и анода соответственно). В одну из лунок вносят антитела, в другую - содержащий антиген раствор. Под действием электрического поля компоненты двигаются гораздо быстрее, чем при обычной диффузии, поэтому преципитаты в центральной части геля будут образовываться в течение 1-3часов. К тому же чувствительность электросинереза приблизительно в 10 раз выше, чем у метода Оухтерлони, т. е. можно обнаруживать антигены, присутствующие в небольших концентрациях. Недостаток метода в том, что он не может быть применим к любым антигенам.
Описанные выше варианты иммуноэлектрофореза позволяют выявить антиген, но не определить его количество. Количественным методом (фактически модификацией иммунодиффузии по Манчини) является так называемый ракетный иммуноэлектрофорез. Для его постановки в охлажденный до 50°С гелеобразующий раствор вносят подогретую до такой же температуры сыворотку с таким расчетом, чтобы она составляла 1-5 % геля, перемешивают и готовят пластинку геля. После внесения в лунки антигенов проводят электрофорез, условия которого подбирают так, чтобы максимально ограничить смещение молекул антител в электрическом поле (чаще всего используют барбиталовый буфер с рН 8,6 и низкое напряжение). Время электрофореза должно обеспечить выход всех молекул антигена из лунки в гель и вхождение их в состав преципитата, обычно это происходит в течение двух часов. Преципитаты в таких условиях образуются в зонах по ходу движения антигена, которые имеют форму вытянутого конуса (ракеты). Длина зоны образования преципитата пропорциональна концентрации антигена, что дает возможность, измерив длину «ракеты» и используя специально построенный калибровочный график, определить количество антигена в пробе.
Вариантом ракетного иммуноэлектрофореза является так называемый перекрестный электрофорез. Для его постановки готовят обычной гель и проводят обычный электрофорез анализируемой пробы. При этом используют одну пробу и лунку располагают у одного из краев пластинки. После проведения электрофореза часть пластинки (около 4/5 от исходного размера) отрезают и удаляют, оставляя только ту часть, в которой находится дорожка первого электрофореза. Затем в ту же камеру заливают гелеобразующий раствор с сывороткой так, чтобы оставшийся участок пластинки объединился с новым, содержащим сыворотку, гелем. Меняют положение пластинки (или электродов) так, чтобы направление движения антигенов было перпендикулярным тому, которое было при первом форезе, и проводят второй форез в условиях, как для ракетного. Учет результатов проводят, как описано выше. В таком варианте результаты могут оказаться более точными, в силу того, что при втором форезе анализируемыми образцами, фактически, оказываются чистые однородные белки.
Описанные выше реакции агглютинации и преципитации были введены в практику еще в конце XIX века и не утратили своего значения до сих пор, но уже в первые годы их применения стало понятно, что их разрешающая способность не всегда удовлетворяет исследователей. В частности, при малых концентрациях того или иного реагента образующиеся комплексы настолько невелики по размерам, что даже с применением микроскопии не могут быть фиксированы исследователем. Поэтому постоянно проводились попытки подобрать условия для более выраженной визуализации результатов взаимодействия антиген- антитело. Одной из успешных попыток стало применение эритроцитов крови в качестве носителей антигена.
Постановка реакции преципитации в геле.
Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.
Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.
Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.
Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.
Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.
Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.
Линии из преципитата.
Агаровый гель.
Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.
С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.
Реакции лизиса.
Для этого надо знать:
Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.
Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.
Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.
3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.
Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).
Постановка реакции гемолиза .
Для постановки реакции гемолиза необходимы:
3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;
Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);
Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.
Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.
Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.
Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата -помутнение.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в"вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.
15. Реакция с участием комплемента: реакция гемолиза, реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, применение.
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент
комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана)
Cтраница 1
Реакция преципитации (РП) отличается от реакции агглютинации размером частиц антигена и видом образующегося феномена.
Реакция преципитации происходит в два этапа, во время которых реагирующие молекулы антигена и антител связываются друг с другом без каких-либо заметных изменений своей исходной химической структуры. Связывание антигена с антителами специфично, причем эта реакция частично или полностью обратима.
Реакция преципитации происходит вскоре после смешивания растворов антигена и иммунной сыворотки.
Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора АГ (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) в растворе электролита.
Для реакции преципитации необходимо оптимальное соотношение концентраций антигена и антител. В избытке антигена преципитат частично или полностью растворяется; в результате бывает невозможно оценить реакцию или же эта оценка может быть ошибочной. В то время как преципитаты, образованные кроличьими антителами, растворяются только при избытке антигена, преципитаты, образованные антителами лошади, часто могут растворяться в избытке как антигена, так и антител.
Для реакции преципитации оптимальными являются те значения температуры, рН и ионной силы среды, которые существуют в организме. Ход реакции преципитации зависит от ионной силы раствора: с увеличением концентрации соли выше 0 15 М постепенно замедляется образование преципитата. В то же время рН среды в довольно широком диапазоне, от 6 5 до 8 6, не влияет на реакцию преципитации.
Для реакции преципитации необходимо иметь специфические антисыворотки достаточно высокого титра.
Если реакция преципитации происходит в зоне эквивалентности, то, определив азот преципитата, можно вычислить соотношение реагирующих компонентов.
Этих недостатков лишена реакция преципитации в геле.
На первом этапе реакции преципитации происходит связывание молекул антигена с антителами, но видимых преципитатов не образуется. На втором этапе реакции происходит агрегация возникших ранее комплексов антиген - антитело с образованием больших нерастворимых частиц, видимых невооруженным глазом. Первый этап реакции протекает быстрее, более обратим и специфичен, чем второй.
Для экспресс-диагностики используют реакцию иммунной преципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими антителами. Готовят 2 % - ю суспензию фекалий, центрифугируют и пропускают ее через фильтр с диаметром пор 1 2 мкм. Суспензию (0 2 мл) смешивают с 0 2 мл разведенной иммунной сыворотки, выдерживают смесь 1 ч при 37 С и центрифугируют 1 ч при 12000 об / мин. Осадок ресуспензируют в 0 2 мл фосфатного буфера и добавляют 0 2 мл флюоресцирующего иммуноглобулина. После инкубации в течение 10 мин смесь центрифугируют 10 мин при 2000 об / мин, осадок ресуспензируют в фосфатном буфере, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под иммерсионным объективом в люминесцентном микроскопе.
Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации, очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны.
При исследовании разложившихся трупов грызунов применяют реакцию преципитации, так как выделить чистую культуру бактерий в этом случае трудно.
Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в тонком слое геля.