Тромбоциты по фонио. Исследование тромбоцитов по фонио Определение тромбоцитов в крови

Тромбоциты участвуют во всем процессе свертывания крови, начиная от образования первичного тромба в области повреждения кровеносных сосудов и заканчивая участием в процессах регулирования проницаемости и тонуса сосудов.

Подсчет максимально точного количества тромбоцитов осуществляется при помощи камеры Горяева и метода Фонио. Подсчет тромбоцитов по Фонио довольно точен. Метод Фонио является наиболее удобным именно при автоматическом подсчете.

Необходимые реактивы

Для определения точного количества тромбоцитов по данному методу потребуются такие реактивы как:

раствор сульфата магния 14% (обязательно стерильный);
краситель Романовского – Гимзы;
фиксаторы Лейшмана либо Май-Грюнвальд.

Как готовится препарат

Кожа пальца вытирается максимально на сухо и аккуратно прокалывается.

Затем на кожу наносят маленькую капельку раствора сульфата магния и после смешивают его с выделившейся каплей крови. Из получившейся смеси готовят мазки, которые высушивают и открашивают по Паппенгейму.

Как считаются тромбоциты

В мазке, подвергнутом окрашиванию, считают 1000 эритроцитов и все попавшиеся тромбоциты. В итоге получается число, выражаемое промилле. Чтобы получить абсолютное количество тромбоцитов нужно данную величину перемножить на количество эритроцитов, имеющихся в 1 мкл, а затем разделить на 1000.

К примеру, если в мазках обнаружено 64 промилле тромбоцитов, эритроциты считаются 5 x 10 в 1 мкл, а тромбоциты 64 x 3,5 x 10 разделить на 1000 равно 224 x 10 в 3 степени в 1 мкл.

где Х - число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах, 20 - разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250 -объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.

При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.

Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) – 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).

Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:

150 клеток (общее количество - 45*109/л (количество клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов, полученное при подсчете в камере полученное при подсчете или на анализаторе)

лейкоцитарной формулы)

100 клеток (лейкоциты) - Х (истинный лейкоцитоз крови)

Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.

Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).

Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис

лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и др., 2002)

2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов.

Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)

Метод подсчета в камере.

Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру. Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.

Расчет тромбоцитов проводят по формуле:

где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000.

Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная аналитика, 1999)

Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).

Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.

Например: А=60‰; число эритроцитов 5 *1012/л

Составляют пропорцию: 60 - 1000

Х - 5*1012/л, откуда

Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0 * 109/л

В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов (фирма «Гем»). (Луговская и др., 2002)

Заключение.

Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований, исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории нуждаются в разработке новых более совершенных методов.

Общий анализ крови позволяет получить ценную диагностическую информацию. Часто в лабораториях используют автоматические гематологические счетчики, позволяющие оценить количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и некоторых других форменных элементов крови. Несмотря на удобство проведения автоматического подсчета, наиболее информативными считаются методы микроскопического исследования. Один из них – тромбоциты по Фонио.

Что такое тромбоциты

Тромбоцитами называют безъядерные клетки крови, которые синтезируются тканями красного костного мозга. Цикл их жизнедеятельности составляет около 7 суток, после чего они утилизируются в печени и селезенке. У тромбоцитов процесс старения выражен более, чем у других форменных элементов крови.

Как и другие составляющие крови, тромбоциты делятся на молодые, зрелые и старые. У здорового человека количество зрелых клеток не должно превышать 95%. Если при анализе обнаруживается большая концентрация молодых телец, это свидетельствует о развитии некоторых заболеваний, среди которых можно назвать многочисленные повреждения кровеносных сосудов и прочее. Кроме молодых, в плазме крови нередко обнаруживаются старые тромбоциты. Такое явление говорит о нарушении процесса производства и утилизации клеток.

Роль в организме

Тромбоциты принимают активное участие в процессах, связанных с образованием тромбов. Они также производят специальное вещество, необходимое для регенерации тканей, стимуляции деления клеток, регулировки уровня проницаемости клеточных мембран и поддержания эластичности сосудов.

Ценное значение количественный и качественный состав тромбоцитов имеет при диагностике заболеваний сердца и сосудов. Высокое количество этих телец называется тромбоцитозом, пониженное – тромбоцитопенией.

Важно! В зависимости от возраста клетки имеют разную степень окрашивания, что дает возможность использовать этот морфологический признак для проведения дифференциальной диагностики.

В чем заключается метод Фонио

Подсчет тромбоцитов по Фонио – это анализ, помогающий выявить точное количество этих телец в крови, диагностировать многие заболевания у человека. При этом подсчет тромбоцитов осуществляется в мазке крови на тысячу эритроцитов, после чего это число пересчитывается в соотношении на 1 микролитр или литр. Методика считается очень точной, применяется для диагностики многих патологий.

Во время анализа кровь окрашивается по методу Романовского-Гимзе

Для проведения анализа кровь берется из пальца. Общее количество тромбоцитов в единице крови называется коагулограммой. Этот вид исследования назначают каждому пациенту, ведь анализ помогает заподозрить и выявить многие болезни.

Подготовка к анализу

На результат анализа тромбоцитов по Фонио могут повлиять некоторые факторы. В связи с этим необходимо правильно подготовиться к сдаче крови. Пациенту накануне перед забором биологического материала следует учесть следующие рекомендации:

сдача крови должна проводиться через 8 часов после последнего приема пищи, так как многие продукты способны повлиять на цветовой показатель форменных элементов крови;
накануне перед анализом нельзя заниматься спортом. Если человек выполнял любые физические нагрузки, результат исследования может быть неточным;
забор материала осуществляется в утреннее время;
наиболее точную информацию можно получить при сдаче крови повторно. Это помогает проследить за концентрацией тромбоцитов в динамике.

Кроме этого, врачу следует обязательно сообщить, принимались ли до этого какие-либо медикаментозные средства. Многие лекарства также способны исказить результат.

Подсчет тромбоцитов по Фонио

При подсчете тромбоцитов лаборант применяет несколько видов реактивов. Это этилендиаминтетраацетат натрия или сульфат магния. Реактивы берутся с помощью пипетки СЕЭ-метра.

Анализ проводится в несколько этапов:

В пробирку добавляют один из реактивов и кровь с помощью пипетки. Количество реактива берется до отметки 75, объем крови – до отметки К.
Полученную массу хорошо перемешивают и используют для изготовления мазков.
Если применяется магния сульфат, мазок окрашивается по методу Романовского-Гимзе на протяжении 120 минут и 45 минут, если лаборант берет этилендиаминтетраацетат натрия. При этом тромбоциты окрашиваются в фиолетово-розовый цвет.

Подсчет тромбоцитов проводят через микроскоп

С помощью микроскопа производится подсчет тромбоцитов и эритроцитов до тысячи красных телец крови. Чтобы узнать количество тромбоцитов, их умножают на число эритроцитов в 1 микролитре, после чего делят полученную цифру на тысячу. Получить наиболее достоверные результаты помогает специфический окрас исследуемых клеток. Именно поэтому многие специалисты при постановке диагноза используют метод подсчета тромбоцитов по Фонио.

Преимущества методики

Способ подсчета эритроцитов по Фонио успешно применяется многими врачами на протяжении многих лет. Техника имеет ряд преимуществ, среди которых выделяют:

при рассмотрении крови под микроскопом лаборант четко видит исследуемый материал, цвет, форму, число клеток;
при необходимости анализ можно проводить в любое время суток;
метод прост в использовании, что связано с простой формулой, но в то же время очень информативен.

Важно! Несмотря на то что медицина не стоит на месте и на сегодняшний день существуют новые методики подсчета частиц крови, метод Фонио не уступает им в своей точности и информативности.

О чем могут свидетельствовать низкие показатели

Тромбоцитопения или пониженная концентрация эритроцитов в крови у человека свидетельствует о развитии различных нежелательных состояний. К наиболее частым причинам низких показателей относят:

радиационное облучение больного;
воздействие на организм свинца и прочих вредных веществ;
патологии системы кроветворения;
коллагенозы у пациента (совокупность заболеваний, касающихся соединительной ткани);
наследственную предрасположенность;
хронический нефрит.

У больных с тромбоцитопенией наблюдаются такие клинические проявления, как частые носовые кровотечения, кровоточивость десен, подкожные геморрагии. У женщин заболевание проявляется в виде обильных и длительных месячных.

Тромбоцитопения вызывает склонность к кровоточивости

Лечение такого состояния подразумевает устранение основной причины, повлекшей за собой нарушение. При этом используется терапия с помощью медикаментозных средств. В особо тяжелых случаях проводится удаление селезенки или трансплантация костного мозга.

Причины повышенных показателей

При повышении числа рассматриваемых клеток на единицу крови речь идет о тромбоцитозе. Как правило, это вторичная патология, возникающая на фоне следующих состояний:

лечение с помощью некоторых медикаментов;
перенесенное оперативное вмешательство;
удаление селезенки;
обильные кровопотери;
воспаление оболочки головного мозга;
патологии почек и печени;
развитие онкологических образований;
железодефицитная анемия.

Наибольшая опасность тромбоцитоза заключается в образовании кровяных сгустков, способных закупоривать артерии. Это нередко ведет к инфарктам, инсультам и другим опасным заболеваниям.

Норма клеток у различных групп населения

При проведении анализа по методу Фонио используется норма от 120 до 400 тыс. клеток в кубическом миллиметре исследуемого материала. Колебание границ зависит от возраста пациента и его половой принадлежности. У женщин, мужчин и детей отклонения в пределах этих границ считаются нормой.

Нормальные показатели:

дети до года – от 100 до 420 тыс. на мм 3 ;
дети от года – от 180 до 320 тыс. на мм 3 ;
мужчины – от 180 до 400 тыс. на мм 3 ;
женщины от 180 до 340 тыс. на мм 3 .

У подростков уровень тромбоцитов может снижаться до 70 тыс. на мм3. У мужчин максимальное количество этих телец отмечается в возрасте 40 лет. Такие отклонения обязательно учитываются при постановке диагноза, объясняются физиологическими и возрастными особенностями организма.

Что влияет на уровень тромбоцитов в крови

Уменьшение или рост рассматриваемых клеток не всегда свидетельствует о развитии какой-либо патологии. Иногда уровень этих телец колеблется вследствие интенсивных и регулярных физических нагрузок, при неправильном питании. Многим людям может показаться странным тот факт, что при потере крови уровень тромбоцитов возрастает. Это объясняется попыткой организма компенсировать потерю крови повышенной выработкой ее форменных элементов.

Стрессы и вредные привычки могут повлиять на уровень тромбоцитов в крови

Часто показатели повышены у людей, употребляющих алкоголь на протяжении длительного времени. Нарушается норма тромбоцитов во время приема медикаментов с тромбоцитопеническим действием. Повлиять на результаты анализа может даже безобидное кровотечение из носа.

Методы нормализации показателей

Первое, что нужно сделать при обнаружении повышенных или пониженных показателей тромбоцитов в крови, это провести дальнейшее обследование пациента с целью выявления патологии, повлекшей за собой такое состояние. Главный метод терапии тромбоцитопении и тромбоцитоза – борьба с первопричиной. Если же нарушение развивается по безобидным причинам, повысить количество тромбоцитов можно с помощью таких способов:

отказаться от вредных продуктов, исключить из рациона алкогольные напитки, красный виноград, зеленый чай, чернику, томаты;
включить в ежедневный рацион яблоки, гречневую кашу, рыбные блюда, болгарский перец, печень;
по назначению специалиста принимаются специальные медикаментозные средства;
повысить количество клеток помогут витамины группы А, В и С.

Понизить концентрацию рассматриваемых элементов крови поможет отказ от экстремальных видов спорта, адекватная оценка стрессовых ситуаций, избегание конфликтов дома и на работе.

Для снижения тромбоцитов специалисты рекомендуют выполнять следующие правила:

принимать ацетилсалициловую кислоту в соответствии с назначением лечащего врача;
исключить из питания шиповник, гранат, манго и другие блюда, которые повышают уровень тромбоцитов;
пить препараты магния курсами несколько раз в год;
употреблять не менее полутора литров воды в сутки.

Подсчет тромбоцитов по методу Фонио – это один из наиболее точных методов исследования крови. С помощью такого анализа врач может выяснить многие патологии, подобрать соответствующее лечение для пациента. Проводится этот анализ также с профилактической целью, что необходимо для ранней диагностики заболеваний и недопущения развития серьезных последствий на их фоне.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ

Микроскопический метод подсчета

Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т. е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония . При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.

Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.

Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.

Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.

Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм2, высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).

Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 109/л. Ошибка метода ± 6,5%.

Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.

Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура

Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов больного

Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения

Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов

Лекарственная тромбоцитопения

Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном

Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией

Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности тромбоцитов, или против измененных тромбоцитарных антигенов

Аллоиммунная тромбоцитопения

Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов плода или переливаемых тромбоцитов

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура

Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах матери

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит , туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях , лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

Тромбоцитозы

Тромбоцитоз	Заболевания и синдромы
Реактивный	Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз, состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит
Опухолевый	Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, идиопатический миелофиброз, эритремия, хронический мегакариоцитарный лейкоз), острый мегакариобластный лейкоз, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия

Средний объем тромбоцита (МРV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Методы определения длительности кровотечения

Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht<0,20) из-за нарушения участия эритроцитов в процессе первичного гемостаза.

Помимо решения диагностических задач тест рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т. к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее.

В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения; проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению.

К первым методам относится тест Duke , при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 4 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести.

Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции.

Определение длительности кровотечения по методу Айви

Принцип метода

Оценивают длительность кровотечения после разреза кожи предплечья скарификатором с глубиной разреза 3 мм. Стандартизация метода достигается равной глубиной кожного разреза и созданием венозного стаза путем повышения венозного давления до 40 мм рт. ст. при помощи сфигмома-нометра, что предупреждает эффект преждевременного склеивания краев раны.

Реактивы и оборудование

70% раствор этанола.

Сфигмоманометр.

Скарификатор, способный осуществить разрез кожи глубиной 2-3 мм.

Ход выполнения

Сфигмоманометр накладывают на плечо, нагнетают в нем давление, равное 40 мм рт. ст., и поддерживают такое давление в течение всего исследования.

Ладонную поверхность предплечья обрабатывают раствором этанола.

Натягивают кожу предплечья в поперечном (по отношению к костям предплечья) направлении.

Скарификатором наносят три разреза кожи по 5-10 мм (направление разреза должно быть перпендикулярно натяжению кожи предплечья, т. е. параллельно костям предплечья) глубиной 3 мм и включают секундомер.

Капли крови осторожно удаляют фильтровальной бумагой путем ее смачивания через каждые 15-30 с.

Регистрируют время остановки кровотечения из каждой ранки.

Снижают давление в манжете сфигмоманометра.

Вычисляют средний результат длительности кровотечения для каждого из трех разрезов.

Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения , однако метод Айви отличается от аналогичных неплохой воспроизводимостью и малой травматичностью. В оригинальном исполнении нормальное время кровотечения не превышает 8 мин, однако указанный норматив условен, поскольку результаты определения длительности кровотечения этим методом значимо варьируют в зависимости от варианта скарификатора и опыта исследователя, поэтому необходимо уточнить нормативы для каждой лаборатории. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда длительность кровотечения часто удлинена, а при изолированных дефектах коагуляцион-ного гемостаза (гемофилии и др.) длительность кровотечения не отличается от нормы.

Причины ошибок

Нестандартный скарификатор, неглубокий (менее 3 мм) разрез кожи, недостаточная квалификация лаборанта.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов

Принцип метода

Тромбоциты способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин , арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген , фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агре-гатограммы этим прибором - принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе агрегации тромбоцитов. В случае нарушения агрегационной функции тромбоцитов происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.

Забор крови и подготовка плазмы для исследования

После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.

Материалом для исследования является бедная тромбоцитами плазма.

БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую тромбоцитами плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при g.

Реактивы и оборудование

0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H507).

Агрегометр с компьютером и принтером.

Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации тромбоцитов.

Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации тромбоцитов

Индукторы тромбоцитарной агрегации	Конечные концентрации индукторов

Адреналин
Коллаген
Арахидоновая кислота
Ристоцетин
Ристоцетин для диагностики 2В типа болезни Виллебранда

Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число тромбоцитов на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.

Ход определения

Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная тромбоцитами плазма.

Поскольку при разном числе тромбоцитов необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом тромбоцитов для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа тромбоцитов следует развести богатую тромбоцитами плазму бедной таким образом, чтобы число тромбоцитов стало равным 150-300 х 109. Например, число тромбоцитов 600 х 109, поэтому исследуемую богатую тромбоцитами плазму необходимо развести бедной тромбоцитами плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число тромбоцитов.

Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой тромбоцитами плазмами.

В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой тромбоцитами плазмы (со стандартным числом тромбоцитов 150-300 х 109), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60-120 с для нагрева богатой тромбоцитами плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.

Оценка результатов исследования

Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа тромбоцитов, конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции тромбоцитов нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.

Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации тромбоцитов использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1-1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов.

Причины ошибок

Тест очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.

Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.

Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.

Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.

Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.

Неточное определение числа тромбоцитов и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов является причиной ошибок.

Варианты результатов записи агрегации тромбоцитов методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Патология гемостаза		Арахи-доновая кислота	Коллаген	Адреналин	Ристоцетин
Тромбоцитопатия	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*
Влияние аспирина или других нестероидных противовоспалительных препаратов		Отсутствие или значимое снижение	Норма для концентрации 5 ug/ml или снижение для концентрации 2 ug/ml	Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-	Норма или умеренное снижение
Нарушение пула хранения	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны			Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-грамме
Синдром Бернара-Сулье					Отсутствие или значимое снижение
Нарушение реакций высвобождения (секреции) из тромбоцитарных гранул	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны			Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-
Тромбастения Гланцманна	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие
Болезнь Виллебранда					Отсутствие или значимое снижение (иногда норма при 2N, повышение при типе 2В)

При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.

Иногда диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.

Существует три метода определения количества тромбоцитов:

1) Подсчет тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазовоконтрастной приставкой. Коэффициент вариации 25-30%

2) Подсчет тромбоцитов в мазке крови (по Фонио), Коэффициент вариации 10-15%. Достоинство – возможность оценить морфологические особенности тромбоцитов.

3) Определение количества тромбоцитов на гематологическом анализаторе,

коэффициент вариации 4-10%.

Метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазовоконтрастной приставкой.

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазовоконтрастную микроскопию.

Реактивы: 1 % раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия – 9:1). Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазовоконтрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4 .

Метод подсчета тромбоцитов в мазках крови (по Фонио)

Принцип. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 6% раствор этилендиаминтриацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения. Смешивают кровь с раствором ЭДТА, для этого взятый капилляром Панченкова реактив до метки «75» вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 30-45 минут (обычно окраска тромбоцитов занимает в 1,5 – 2 раза больше времени, чем окраска мазка для подсчета формулы крови). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая тромбоциты в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолировано). Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения считают количество эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: Количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А0/00. Зная число эритроцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчитать количество тромбоцитов в 1 мкл крови (в 1 л).

Например. А=600/00 ; число эритроцитов 5 000000 в 1 мкл (5*106/мкл или 5*1012/л)

Составляют пропорцию:

Х – 5000000,откуда

Х= 60*5*1000000/1000=300*1000 мкл (300*103/мкл или 300*109/л).

Определение количества тромбоцитов с помощью гематологического анализатора

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови, или гематологических анализаторов. Эти аппараты точны, и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Подсчет тромбоцитов проводят согласно инструкции к аппарату. Бюджетные модели гематологических анализаторов определяют только количество тромбоцитов, а более совершенные приборы содержат полный анализ тромбоцитарного звена, и позволяют говорить о морфологии тромбоцитов. Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели:

РLТ – количество тромбоцитов.

Норма от 180-320109/л; При выходе за эти пределы необходима микроскопия мазка.

MPV – средний объем тромбоцитов. «Молодые» тромбоциты имеют больший объем. MPV увеличивается с возрастом. Норма: 8,6-8,9 фл у детей 1 – 5 лет; 9,5-10,6 фл у людей старше 70 лет.

PDV ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма = 14-18%.

РСТ – тромбокрит доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен Hct). Норма = 0,15-0,40%.

Также гематологический анализатор строит график распределения тромбоцитов по размеру .