Белок p53, антитела IgG (количественное определение). Anti-p53-Ab
|
Показатель |
Характеристика |
|
Материал |
Венозная кровь |
|
Правила подготовки пациента |
Стандартные, см. раздел № 15 |
|
Транспортная среда, пробирка |
|
|
Стандартные, см. раздел № 17 |
|
|
Метод тестирования |
|
|
Анализатор и тест - система |
|
|
Референтные значения , E д/мл |
Описание:
Антигеном для данных антител является белок p53, осуществляющий контроль над течением процессов клеточного цикла, а также за наличием в геноме повреждений, которые могли бы привести к дальнейшему развитию патологии. p53-зависимый апоптоз - мощный селектор, позволяющий избежать накопления мутаций, а в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки.
Ген-супрессор опухолевого роста, мутации в котором обнаруживаются в 50% случаев заболевания раком всех типов. Этот ген кодирует транскрипционный фактор, контролирующий вхождение клетки в клеточный цикл. Многие внутриклеточные системы, следящие за «здоровьем» клетки, передают сигналы о «неполадках» белку р53. С его помощью клетка принимает решение, делиться или не делиться. Если клетка несёт неисправимые повреждения, белок р53 запускает цепь событий, приводящих к «самоубийству» клетки, иначе называемому апоптозом. Клетки, в которых нет р53 или в которых он неправильно функционирует, не способны к подобному самоконтролю и продолжают делиться, даже когда это становится опасным для организма. Как и все супрессоры опухолевого роста, р53 контролирует нормальное протекание клеточного цикла.
Согласно исследованиям последних 5 лет, наиболее актуальным является контроль данного показателя при таких состояниях, как онкологические заболевания (рак яичников, немелкоклеточный рак легких и др.), ГЭРБ, ЯБЖ, ЯБДПК, хронический гастрит типа В.
|
Показатель |
Характеристика |
|
Материал |
Венозная кровь |
|
Правила подготовки пациента |
Стандартные, см. раздел № 15 |
|
Транспортная среда, пробирка |
Вакутайнер с/без антикоагулянта с/без гелевой фазы |
|
Правила и условия транспортировки, стабильность пробы |
Стандартные, см. раздел № 17 |
|
Метод тестирования |
|
|
Анализатор и тест - система |
Photometer Fa. Tecan; Fa. Dianova |
|
Референтные значения , E д/мл |
Как подготовиться к анализу:
Анализ крови
Для исключения факторов, которые могут влиять на результаты исследования, необходимо придерживаться следующих правил подготовки:
- кровь для исследования сдается только натощак!
- перед сдачей венозной крови желательно 15 мин.отдых;
- за 12 часов до исследования следует исключить прием алкоголя, курение, прием пищи, ограничить физическую активность;
- исключить прием лекарств. Если отменить прием лекарств невозможно, необходимо проинформировать об этом лабораторию;
- детей до 5 лет, перед сдачей крови, обязательно поить кипяченной водой (порциями, до 150-200 ml, на протяжении 30 минут)
Услуга временно недоступна
Белок p53, названный биологами стражем генома, регулирует деление клеток. Его запуск связан с различными деформациями и повреждениями в геноме клетки, которые впоследствии могут привести к образованию опухолей при ее делении.
Запуск данного белка контролирует размножение клетки и в случае повреждения ее ДНК не дает ей делиться и, более того, запускает апоптоз, который обеспечивает уничтожение дефективной клетки с поврежденным геномом. В то же время, мутации в самом p53 приводят к нарушению его функций, из-за чего он также может вызвать возникновение раковых опухолей. Однако функции данного белка до конца не изучены, а последние эксперименты показали, что он не только отвечает за уничтожение «больных» клеток, но и регулирует деятельность здоровых, что говорит о его влиянии не только на здоровье человека, но и на его долголетие.
Белок p53 в человеческом организме
В организме человека присутствуют два аллеля этого белка: R72, содержащий на семьдесят втором месте аминокислоту аргинин, и P72, содержащий на том же месте пролин. Различие в данных белках обусловлено вариациями нуклеотида TP-53, кодирующего формулу данного белкового соединения, и влияет на активность p53 в человеческом организме. Так, белок R72 лучше связывается с ДНК и сильнее регулирует генетическую транскрипцию, в то время как P72 является более слабым аллелем. У людей с белком P72 чаще обнаруживают рак ввиду того, что белок менее активен, однако, именно его чаще обнаруживают у долгожителей. Неясно, действительно ли более слабый аллель белка p53 является частично причиной более частых случаев возникновения новообразований у людей с белком P72, но определенные закономерности дают возможность предполагать, что как образование раковых опухолей, так и долголетие связаны именно с ним.
Предыдущие эксперименты и выводы о работе белка p53
Множество доказательств двойственной функции данного белка собраны во время экспериментов с мышами. Так, в одном из опытов ученые сделали p53, обычно активируемый по сигналу организма, активным постоянно, что увеличило здоровье лабораторных мышей и уменьшило процент возникновения у них раковых опухолей, однако, в то же время вызвало их ускоренное старение. Еще один эксперимент был связан с попыткой добавить в геном мышей дополнительную копию гена TP53, который отвечает за кодировку белка p53. В этом случае мыши не болели раком и при этом не старели, но эксперимент не воспроизводит реальность.
Результаты недавних экспериментов с человеческим белком
Для новой серии экспериментов были выведены особый вид мышей — hupki, особенность которых заключается в наличии у них человеческого гена TP53 вместо мышиного, что позволяет более точно установить функции и возможности каждого из аллелей. Мышей разделили на две группы по тому, какого аллеля белок вырабатывался в их телах, а для чистоты эксперимента подопытные мыши были скрещены с лабораторными. Потомство соответственно приобрело человеческий ген TP53, кодирующий образование в организме человеческого белка p53 в виде более слабого аллеля P72 и аллеля R72, который более сильный. Выживаемость этих мышей и признаки их старения изучались учеными на протяжении периода длиной в два года.
В результате данных экспериментов отмечено, что мыши с аллелем P72, как и ожидалось, демонстрировали более частое образование злокачественных новообразований и более высокую смертность по этой причине. Однако в то же время по другим показателям они превзошли мышей с аллелем R72. Так, отмечено, что в среднем продолжительность их жизни была больше, чем у мышей с более сильным аллелем данного белка, а смертность из-за других причин, не связанных с возникновением атипичных клеток, была ниже, в свою очередь выживаемость среди мышей в возрасте полутора лет и выше была, напротив, более высокой.
Во время проведения экспериментов было доказано, что организм мышей с аллелем P72 стареет медленнее. Среди показателей старения, изученных учеными, были искривление шейного лордоза, состояние костной ткани и ее плотность, состояние кожи и ПЖК (подкожно-жировой клетчатки), скорость регенерации организма, а также число стволовых клеток. Было замечено, что угол искривления позвоночника у подопытных особей с аллелем P72 в возрасте полутора лет приближен к его показателю для грызунов в возрасте полугода, в то время как мыши с аллелем R72 демонстрируют сильную деформацию шейного отдела позвоночника. Томограмма черепа мышей с этими двумя аллелями белков также выявила гораздо меньшее количество возрастных изменений у особей с аллелем P72. Возрастное истончение кожи и подкожного жирового слоя у них также происходило медленнее в сравнении с особями с белком R72. Кроме того, мыши с более слабым аллелем данного белкового соединения демонстрируют более высокую способность к заживлению ран в преклонном возрасте. Количество стволовых клеток крови у мышей с более слабым аллелем P72 также снижалось менее резко, чем у мышей с белком R72.
Были проведены также эксперименты по проверке восстановительных способностей стволовых клеток мышей с аллелями R72 и P72 белка p53. В данном опыте исследователи облучали мышей, обладающих немодифицированным белком р53, убивая их стволовые клетки крови, и после подсаживали в их организм стволовые клетки мышей с человеческим вариантом белка р53 обоих аллелей. По результатам этого эксперимента были сделаны выводы, что стволовые клетки мышей с более сильным аллелем данного белка с возрастом теряют способность к восстановлению, в то время как у мышей с аллелем P72 стволовые клетки сохраняют свои свойства гораздо лучше.
Выводы о функциях белка p53 в организме
Как видно из экспериментов, хотя более сильный аллель белка р53 R72 действительно препятствует образованию атипичных клеток, провоцирующих возникновение злокачественных новообразований, блокируя деление дефективных клеток, в то же время он снижает способности клеток к регенерации. Его работа, обеспечивающая организм человека лучшим здоровьем в репродуктивный период, в то же время блокирует механизм долголетия благодаря быстрому снижению восстановительных способностей организма. В то же время аллель Р72, для которого характерны более слабые способности к связыванию с ДНК, хоть и не обеспечивает крепкую защиту от различных раковых новообразований в организме, в то же время поддерживает его способности к регенерации и возобновлению ресурсов организма. Можно сказать, что белок p53 выполняет двойственные функции и регулирует как злокачественные изменения организма, так и его восстановительные способности, и является одним из ключей к контролю заболеваемости раком среди человеческого населения. И даже само существования двух аллелей данного белка подчеркивает их необходимость в организме не только с точки зрения контроля белком р53 дефектных клеток и их уничтожения, но и с точки зрения других его функций, которые пока окончательно не изучены, однако, как видно из экспериментов, влияют на все процессы организма, поддерживая баланс восстановительных возможностей наряду с обеспечением достаточной продолжительности жизни.
Ген p53: страж генома
Ген-супрессор опухолей p53 является одним из наиболее часто мутируемых генов в опухолях человека. p53 препятствует опухолевой трансформации тремя связанными друг с другом механизмами: активация временной остановки клеточного цикла (покой), индукция постоянной остановки клеточного цикла (старение), запуск программированной клеточной гибели (апоптоз). В общем, p53можно рассматривать как контролер клеточного стресса, который направляет клетки, подвергшиеся стрессу, по одному из трех путей. Различные воздействия могут запустить сигнальные пути p53, включая аноксию, неадекватную экспрессию онкогенов (например, MYC или RAS) или нарушение целостности ДНК. Управляя реакцией клетки на повреждение ДНК, p53играет центральную роль в поддержании целостности генома, как мы увидим в дальнейшем.
В здоровых клетках, не подвергшихся воздействию повреждающих факторов, p53 имеет короткий период полураспада (20 минут) вследствие его связи с MDM2, белком который метит его для последующего разрушения. В условиях стресса, например при повреждении ДНК, p53 подвергается посттранскрипционной модификации, в результате чего он высвобождается из связи с MDM2 и его период полураспада увеличивается. Не связанный с MDM2 p53 также приобретает активность как транскрипционный фактор. Обнаружены десятки генов, чья транскрипция активируется p53. Их можно объединить в две большие категории: те, которые вызывают остановку клеточного цикла и те, которые запускают апоптоз. Если повреждение ДНК может быть восстановлено во время остановки цикла, клетка возвращается в нормальное состояние; если репарация оказывается неудачной, p53 запускает апоптоз или процесс клеточного старения. Эти действия будут рассмотрены позже.
Механизмы посредством которых p53 определяет повреждение ДНК, а также адекватность ее репарации, не совсем ясны. Ключевыми инициаторами сигнального пути, связанного с повреждением ДНК являются две родственные протеинкиназы: мутированная при атаксии-телеангиоэктазии (ataxia-teleangiectasia mutated, ATM) и связанная с мутированной при атаксии-телеангиэктазии (ataxia-teleangiectasia mutated related, ATR). Как видно из названия, ген ATM был первоначально идентифицирован как герминоклеточная мутация у пациентов с атаксией-телеангиэктазией. Пациенты с этим заболеванием, которое характеризуется неспособностью репарировать некоторые виды повреждений ДНК, чаще других страдают различными злокачественными новообразованиями. ATM и ATR определяют различные типы повреждения ДНК, однако активируют похожие сигнальные пути. Будучи активированными, ATM и ATR фосфорилируют различные белки, включая p53 и белки репарации ДНК. Фосфорилирование этих двух мишеней ведет к остановке клеточного цикла и стимуляции репарации ДНК, соответственно.
Остановку клеточного цикла, опосредованную p53, можно считать фундаментальной ответной реакцией на повреждение ДНК (рис. 6-22). Это происходит в конце фазы G 1 и вызывается, главным образом, посредством p53 -зависимой транскрипции CDKI CDKN1A (p21) . Ген CDKN1A , как было описано выше, ингибирует комплексы циклин-CDK и препятствует фосфорилированию RB, что необходимо для входа клеток в G 1 фазу. Такая остановка в клеточном цикле весьма удобна, поскольку дает время для проведения репарации ДНК. p53 также помогает этому процессу, индуцируя синтез некоторых белков, таких как GADD45 (growth arrest and DNA damage, приостановка роста и повреждение ДНК), которые помогают в репарации ДНК. Также p53 может стимулировать пути репарации ДНК нетранскрипционными механизмами. Если повреждение ДНК успешно восстановлено, p53 увеличивает транскрипцию MDM2, что ведет к разрушению p53 и снятию блокировки клеточного цикла. Если повреждение не может быть восстановлено, клетка под действием p53 подвергается физиологическому старению или апоптозу.
p53-индуцированное старение – это перманентная остановка клеточного цикла , характеризующаяся специфическими изменениями в клеточной морфологии, экспрессии генов, которые отличают такую клетку от покоящихся клеток при обратимой приостановке клеточного цикла. Старение требует активации p53 и/или RB, а также экспрессии других медиаторов, таких как CDKIs. Такая остановка клеточного цикла обычно необратима, хотя она может требовать продолжающейся экспрессии p53. Механизмы старения неясны, однако что они затрагивают глобальные изменения хроматина, которые коренным образом и навсегда изменяют экспрессию генов.
p53-индуцированный апоптоз клеток с необратимым повреждением ДНК – последний защитный механизм против опухолевой трансформации. Он опосредован несколькими проапоптотическими генами, такими как BAX и PUMA (будет рассмотрено ниже).
Суммируя вышесказанное, p53 определяет повреждение ДНК и способствует ее репарации, вызывая приостановку в фазе G 1 и индуцируя гены репарации ДНК. Клетка с необратимым повреждением ДНК, под действием p53 подвергается либо физиологическому старению либо апоптозу (рис. 6-22). В свете своих свойств, p53 был удачно назван «стражем генома». При гомозиготной потере p53 повреждение ДНК остается неотрепарированным, в делящихся клетках накапливаются мутации, что направляет клетку на путь, ведущий к опухолевой трансформации.
Подтверждением важности p53 в контроле над канцерогенезом является то, что в более чем 70% опухолей человека имеется дефект этого гена, оставшиеся злокачественные опухоли имеют дефекты генов, имеющих отношение к функции p53 . Гомозиготная потеря p53 обнаружена практически во всех злокачественных опухолях, включая раки легкого, толстой кишки и молочной железы – три основные причины смертности от рака. В большинстве случаев, инактивирующие мутации обоих аллелей p53 появляются в соматических клетках. Гораздо реже, некоторые индивидуумы наследуют мутантные аллели p53 . Такое заболевание называется синдром Ли-Фраумени. Как и с геном RB , наследование одного мутантного аллеля делает его носителей предрасположенными к развитию злокачественных опухолей, поскольку требуется только одна мутация для того, чтобы инактивировать вторую, нормальную аллель. Пациенты с синдромом Ли-Фраумени имеют повышенный в 25 раз риск развития злокачественных опухолей к 50 годам, по сравнению с общей популяцией. В отличие от пациентов, которые наследуют мутантный аллель RB , спектр опухолей, развивающихся у пациентов с синдромом Ли-Фраумени более широкий; наиболее часто развиваются саркомы, рак молочной железы, лейкемия, опухоли мозга и карциномы коры надпочечника. По сравнению со спорадическими опухолями, опухоли у пациентов с этим синдромом развиваются в более молодом возрасте и могут быть первично-множественными.
, удвоение центриолей , формирование веретена деления - гарантия неизменности и передачи дочерней клетке генетического материала.
Изменения в геноме можно разбить на три группы:
1) изменение отдельных нуклеотидов ( точечные мутации),
2) внутрихромосомные и межхромосомные перестройки (делеции, амплификации , транспозиции и т. д.),
Не исключено, что р53 контролирует процесс митоза на уровне формирования и/или функции веретена митотического аппарата: клетки, экспрессирующие р53 дикого типа, в ответ на обработку ингибиторами веретена деления (колхицином, разрушающим микротрубочки веретена), были не способны к дальнейшей пролиферации . В отличие от них клетки из -/- по р53 мышей после обработки ингибиторами веретена были способны к новым раундам репликации ДНК (без деления), формируя тетраплоидные и октаплоидные популяции. По-видимому, кроме механизма с участием р53, клетки имеют дополнительную систему регуляции контроля формирования и функции митотического веретена, так как в некоторых линиях клеток человека, где р53 инактивирован как результат экспрессии папилломавирусного белка Е6 или большого Т- антигена вируса SV40 , также наблюдается остановка новых раундов репликации в ответ на обработку ингибиторами веретена. В клетках рака толстой кишки человека нарушение функции р53 дикого типа коррелировало с возникновением тетраплоидов. Это дает основание полагать, что инактивация р53 приводит к возможности эндоредупликации (повторный раунд репликации ДНК без митоза) in vivo ( Carder et al., 1993).
Тетраплоидные популяции клеток найдены во многих солидных опухолях человека и грызунов ( Burholt et al., 1989). Не исключено, что тетраплоидные клетки являются интермедиатами, которые в процессе канцерогенеза превращаются в анеуплодные клетки ( Shackney et al., 1989). Хорошей моделью in vivo являются трансгенные мыши, экспрессирующие большой Т-антиген . Первоначально у них обнаруживают тетраплоидные клетки, а затем многообразные анеуплоидные популяции ( Ornitz et al., 1987). Интересно, что образование тетраплоидов в таких мышах совпадало с увеличением количества центриолей и развитием мультиполярных митозов ( Levine et al., 1991). Таким образом, одна из функций р53 дикого типа как супрессора канцерогенеза , заключается в контроле стабильности генома, возможно, путем ингибирования сборки/функции веретена деления , что приводит к запрещению пролиферации аномальных клеток.
Многие процессы в клетке имеют тканеспецифический характер. Соответственно этому в разных клетках могут меняться требования к р53- зависимому контролю. Высокая пролиферативная активность клеток кишечного эпителия и органов кроветворения, например, требует настройки р53 на повышенную степень готовности. В таких клетках даже незначительные повреждения ДНК могут приводить к р53-зависимому апоптозу. Напротив, в редко делящихся клетках - гепатоцитах и ряде других -в физиологических условиях роль р53 менее заметна. Кроме того, один и тот же тип воздействия в зависимости от ситуации может иметь и физиологический, и патологический характер. Например, активация МАР-киназных каскадов под действием ростовых факторов имеет физиологический характер, в то время как те же процессы, инициированные перманентно активированным онкогеном, относятся к явной патологии. Поэтому физиологические процессы в определенные моменты требуют временного выключения контроля со стороны р53. Если же воздействие переходит некую допустимую для данной клетки черту, то р53-зависимые процессы должны вновь вступать в силу.
Молекула р53 является одним из самых важных видов «оружия» в борьбе с раком. Ученые уже давно изучают, как работает этот «хранитель генома». В 1993 году изображение р53 было на обложке престижного журнала «Science». Этот белок стал чем-то вроде поп-звезды среди всех «ремонтных рабочих» нашего организма. При повреждении клеток он останавливает клеточный цикл и запускает механизм восстановления. В случае слишком серьезного дефекта программирует клетку на самоуничтожение.
Если в организме есть такой «страж», почему же тогда рак по-прежнему уносит жизни миллионов людей? Потому что ген ТР53, который продуцирует р53, мутирует и меняет форму белка, делая его неработоспособным. Кроме того, у р53 есть грозный противник – молекула MDM2. Она связывается с белком р53 и полностью нейтрализует его эффективность.
Восстановление дееспособности этого белка – самая большая мечта исследователей. Едва ли найдется какая-то другая молекула, которой уделяли бы столько внимания. Некоторые ученые пытаются максимально сохранить «работающие» молекулы р53 путем блокирования MDM2.
Исследовательская работа
Компания Рош проводит испытания ингибитора «идазанутлина». Его применяют против острого миелобластного лейкоза. Ранее изучали действие ингибиторов на рак предстательной железы и нейробластому. Главной проблемой при разработке подобных препаратов является наличие побочных эффектов. Так в 2012 году при испытании блокатора опухолей жировой ткани было отмечено опасное снижение количества иммунных клеток.
Есть и другой подход: «лечение» р53, направленное на то, чтобы белок вновь оказался дееспособным. Это более трудный путь, но он стоит усилий, потому что измененный р53 не только теряет способность программировать дефектные клетки на уничтожение, но и становится онкогеном, то есть ускоряет развитие рака. Исследователи с помощью суперкомпьютеров создали динамическую модель р53 и обнаружили в центре белка небольшой «мешочек». В здоровой молекуле этот «карман» открывается на очень короткий промежуток времени. В измененных белках он остается открытым гораздо дольше. Если найти молекулы, которые могут «связать» зазор, можно восстановить функции р53.
Группа ученых во главе с профессором Питером Кайзером из Университета Калифорнии изучила большое количество различных веществ. Было найдено около 3000 «кандидатов», которые могли бы проникнуть в «карман». Из них 10-15% способны реактивировать белки р53 в опухолевых клетках, причем некоторые агенты работают практически со всеми видами мутаций. Это значит, что они могут воздействовать на любые деформированные белки, в том числе на те, которые вызывают болезнь Альцгеймера.
В 2012 году началось тестирование агента АПР-246, который продемонстрировал достаточную эффективность в лечении рака крови.
В 2016 году на ежегодном собрании Европейского онкологического общества были опубликованы результаты второй фазы клинических испытаний АПР-246. Фармацевтическая компания «Aprea Therapeutics AB» использовала препарат в лечении женщин, страдающих раком яичников. Из 22 пациенток с измеримыми поражениями полный ответ наблюдался у трех. У десяти была частичная реакция, у восьми – стабилизация состояния, а у одной женщины изменений не произошло.
Вице-президент «Aprea» доктор Микаэль фон Эйлер отметил, что АПР-246 хорошо сочетается с химиотерапией и увеличивает процент выживаемости больных, устойчивых к противоопухолевым препаратам.
Остается решить вечную проблему: безопасность. Никто не знает, как может отреагировать организм на реактивацию поврежденной версии р53. Тем не менее, такая стратегия является одной из самых перспективных, так как половина всех опухолей связана с дефектами этого белка.