Применение фагов в медицине. Лекция: Применение фагов в медицине и микробиологии. Что такое бактериофаги

Практическое применение фагов. Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также растворённые антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат - жидкий бактериофаг должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости жёлтого цвета большей или меньшей интенсивности.

Для применения с лечебно-профилактическими целями фаги могут выпускаться в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой. Таблетированный сухой фаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата - 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре + 2 +10 С, сухой- не выше +1°С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, прием бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приёму нет. Применяются в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов, инъекций, а также вводят в полости - брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь, в зависимости от места локализации возбудителя.

Диагностические фаги выпускаются как в жидкой, так и сухой форме в ампулах.Перед началом работы сухой бактериофаг разводится. Если на ампулах указан титр,тр, ДРТ (доза рабочего титра) применяют в реакции фаголизабельности (метод Отто) для идентификации бактерий, если указан тип фага, то для фаготипирования– определения источника инфекции.

Действие бактериофага на микробную культуру в жидкой среде и на плотной среде

Метод Отто (стекающая капля)

Делают густой посев газоном исследуемой культуры. Через 5-10 мин после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят жидкий диагностический фаг. Чашку слегка наклоняют, чтобы капля фага растеклась по поверхности агара. Чашку помещают в термостат на 18-24 часа. Учёт результата производят по полному отсутствию роста культуры в месте нанесения капли фага.

Опыт на жидкой питательной среде

Делают посев исследуемой культуры в две пробирки с жидкой средой. В одну пробирку («О») добавляют петлёй диагностический бактериофаг. Через 18-20 часов в пробирке, куда бактериофаг не добавлялся («К»), наблюдается сильное помутнение бульона - произошел рост посеянной культуры. Бульон в пробирке, куда был добавлен бактериофаг, остался прозрачным вследствие лизиса культуры под его влиянием.

Фаготипирование бактерий

По спектру действия различают следующие бактериофаги: поливалентные, лизирующие родственные виды бактерий; моновалентные, лизирующие бактерии определенного вида; типовые, лизирующие отдельные типы (варианты) бактерий.

Например, один штамм патогенного стафилококка может лизироваться несколькими типами фагов, поэтому все типовые фаги (24) и штаммы патогенных стафилококков объединены в 4 группы.

Метод фаготипирования имеет большое значение для эпидемиологического исследования, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. С этой целью определяют фаговар выделенной из патологического материала чистой культуры на плотных питательных средах с помощью типовых диагностических фагов.

Фаговар культуры микроорганизмов определяют по тому типовому фагу, который вызвал ее лизис.Выделение бактерий одного фаговара от разных обследуемых указывает на источник заражения.

Впервые, предположение, что бактериофаги являются вирусами сделал. Д.Эррель. В дальнейшем открыты вирусы грибков и тд, называть стали фаги.

Морфология фага.

Размеры - 20 - 200нм. Большинство фагов имеют форму головастиков. Наиболее сложно устроенные фаги состоят из многогранной головки, в которой располагается нуклеиновая кислота, шейка и отростки. На конце отростка располагается базальная пластинка, с отходящими от нее нитями и зубцами. Эти нити и зубцы служат для прикрепления фага к оболочке бактерии. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. У многих фагов отросток окружен чехлом, который у некоторых фагов может сокращаться.

Различают 5 морфологических групп

Бактериофаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом
Фаги с длинным отростком, но не сокращающимся чехлом
Фаги с коротким отростком
Фаги с аналогом отростка
Нитевидные фаги

Химический состав.

Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белков. Большинство из них содержит 2хнитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Некоторые фаги содержат одну нить ДНК или РНК.

Оболочка фагов - капсид , состоит из упорядоченных белковых субъединиц - капсомеров.

У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму.

Фаги хорошо переносят замораживание, нагревание до 70, высушивание. Чувствительны к кислотам, УФ и кипячению. Фаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействую со специфическими рецепторами клеток.

По специфичности взаимодействия -

Полифаги - взаимодействующие с несколькими родственными видами бактерий

Монофаги - видовые фаги - взаимодействуют с одним видом бактерий

Типовые фаги - взаимодействуют с отдельными вариантами бактерий внутри вида.

По действию типовых фагов вид можно разделить на фаговый ряд . Взаимодействие фагов с бактериями может протекать по продуктивному, апродуктивному и интегративному типу.

Продуктивный тип - образуется фаговое потомство, а клетка лизируется

При апродуктивном - клетка продолжает существовать, процесс взаимодействия обрывается на начальной стадии

Интегративный тип - геном фага интегрирует в хромосому бактерий и сосуществует с ним.

В зависимости от типов взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные взаимодействуют с бактериями по продуктивному типу. В начале происходит абсорбция фага на оболочке бактерий, за счет взаимодействия специфических рецепторов. Имеет место проникновение или пенетрация вирусной нуклеиновой кислоты в цитоплазму бактерий. Под действием Лизоцима в оболочке бактерии образуется небольшое отверстие, чехол у фага сокращается и НК впрыскивается. Оболочка фага за пределами бактерии. Далее осуществляется синтез ранних белков. Они обеспечивают синтез фаговых структурных белков, репликацию фаговой нуклеиновой кислоты и репрессию деятельности бактериальной хромосом.

После этого происходит синтез структурных компонентов фагов и репликация нуклеиновой кислоты. Из этих элементов происходит сборка нового поколения фаговых частиц. Сборка носит название морфогенез, новых частиц, которых в одной бактерии может образовываться 10-100. Далее лизис бактерии и выход нового поколения фагов во внешнюю среду.

Умеренные бактериофаги взаимодействуют либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл идет аналогично. При интегративном взаимодействии - ДНК умеренного фага после попадания в цитоплазму встраивается в хромосому в определенном участке, причем при делении клетки реплицируется синхронно с бактериальной ДНК и вот эти структуры передаются дочерним клеткам. Такая встроенная ДНК фага - профаг , а бактерия, содержащая профаг, называется лизогенной, а явление - лизогения.

Спонтанно, или под влиянием ряда внешних факторов профаг может вырезаться из хромосомы, т.е. переходить в свободное состояние, проявлять свойства вирулентного фага, что будет приводить к образованию нового поколения бактериальных тел - индукция профага .

Лизогенезация бактерий лежит в основе фаговой(лизогенной) конверсии. Под этим понимают изменение признаков или свойств у лизогенных бактерий, по сравнению с нелизогенными того же вида. Изменяться могут разные свойства - морфологические, антигенные и тд.

Умеренные фаги могут быть дефектными - не способными образовывать фаговое потомство не в естественных условиях и в индукции.

Вирион - полноценная вирусная частица, состоящая из НК и белковой оболочки

Практическое применение фагов -

Применение в диагностике. В отношение ряда вида бактерий монофаги, используются в реакция фаголизабельности, как один из критериев идентификации культуры бактерии, типовые фаги применяют для фаготипирования, для внутривидовой дифференциации бактерий. Проводятся с эпидимиологоическими целями, для установления источника инфекции и путей устранения
Для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций - брюшной тип, стафилококковы и стрептококковые инфекции(таблетки с кислотоустойчивым покрытием)
Умеренные бактериофаги применяют в генной инженерии в качестве вектора, способных вносить генетический материал в живую клетку.

Генетика бактерий

Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самовоспроизведению - репликонов. Репликонами является бактериальные хромосомы и плазмиды. Бактериальная хромосома формирует нуклеоид, замкнутым кольцом не связанным с белками и несет гаплоидный набор генов.

Плазмиды представляет собой также замкнутое кольцо молекулы ДНК, но гораздо меньших размеров чем хромосома. Наличии плазмид в цитоплазме бактерий не обязательно, но они придают преимущество в окружающей среде. Крупные плазмиды редуцируются с хромосомой и количество их в клетке небольшое. А число мелких плазмид может достигать нескольких десятков. Некоторые плазмиды способны обратимо встраиваться в бактериальную хромосому в определенном ее участке и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными. Некоторые плазмиды способны передаваться от одной бактерии к другой при непосредственном контакте - коньюгативные плазмиды. Они содержат гены, ответственные за образование F-пилей, формирующих коньюгативный мостик, для передачи генетического материалы.

Основные типы плазмидов-

F - интегративная коньгативная плазмида. Половой фактор, определяет способность бактерий быть донорами при коньюгации

R - плазмиды. Резистентная. Содержит гены, детерминирующие синтез факторов, разрушающих антибактериальные препараты. Бактерии, обладающие такими плазмидами не чувствительны ко многим препаратам. Поэтому формируются устойчивые к препаратам фактор.

Токс плазмиды - детерминирующие факторы патогенности -

Ent - плазмиды - содержит ген за выработку энтеротоксинов.

Hly - разрушают эритроцит.

Подвижные генетические элементы. К ним относятся вставочные - инсерционные элементы . Общепринятое обозначение - Is. Это участки ДНК, способные перемещаться как внутри репликона, так и между ними. Они содержат только гены, необходимые для их собственного перемещения.

Транспозоны - более крупные структуры, обладающие темиже свойствами, что и Is, го помимо они содержат структурные гены, определяющие синтез биологических веществ, например токсинов. Подвижные генетические элементы могут вызывать инактивацию гена, повреждение генетического материала, слияние репликонов и распространение генов в популяции бактерий.

Изменчивость у бактерий.

Все виды изменчивости подразделяют на 2 группы - ненаследственная(фенотипическая, модификационная) и наследственная(генотипическая).

Модификации - фенотипчиеские не наследуемые изменения признаков или свойств. Модификации не затрагивают генотипа, а поэтому не передаются по наследству. Они являются адаптивными реакциями, на изменение каких то конкретных условий внешней среды. Как правило утрачиваются в первом поколении, после прекращения действия фактора.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип организма, а поэтому способна передаваться потомкам. Генотипическая изменчивость подразделяется на мутации и рекомбинации.

Мутации - стойкие, наследуемые изменения признаков или свойств организма. Основа мутаций - качественное или количественное изменение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Мутации могут изменять практически любые свойства.

По происхождению мутации - спонтанные и индуцируемые.

Спонтанные мутации происходит в естественных условиях существования организма, а индцированные возникают в результате направленного действия мутагенного фактора. ПО характеру изменений в первичной структуре ДНК у бактерий различают генные или точковые мутации и хромосомные аберрации.

Генные мутации происходят внутри одного гена и минимально захватывают один нуклеотид. Этот тип мутаций может быть следствием замены одно нуклеотида на другой, выпадения нуклеотида или вставления лишнего.

Хромосомные - могут затрагивать несколько хромосом.

Может быть делеция - потеря участка хромосомы, дупликация - удвоения участка хромосомы. Поворот участка хромосомы на 180 градусов - инверсия.

Любая мутация возникает под действием определенного мутагенного фактора. По своей природе мутагены - физические, химические и биологические. Ионизирующая радиация, рентгеновские лучи, УФ лучи. К химическим мутагенам - аналоги азотистых оснований, саму азотистую кислоту, и даже некоторые лекарственные средства, цитостатики. К биологическим - некоторые вирусы и трансфазоны

Рекомбинация - обмен участками хромосом

Трансдукция - перенос генетического материала с помощью бактериофага

Репарация генетического материала - восстановление возникших в результате мутаций повреждений.

Существует несколько видов репарации

Фотореактивация - этот процесс обеспечивается специальным ферментом, который активируется в присутствии видимого света. Этот фермент перемещается по цепочке ДНК и восстанавливает повреждения. Объединяет тимеры, которые образуются при действии УФ. Более значимы результаты темновой репарации. Она не зависит от света и обеспечивается несколькими ферментами - вначале нуклеазы вырезают поврежденный участок цепи ДНК, затем ДНК полимераза, на матрице сохранившейся комплементарно цепи синтезирует заплату, а лигазы вшивают заплатку на поврежденное место.

Репарации подвергаются генные мутации, а хромосомные как правило нет

Генетические рекомбинации у бактерий. Характеризуются проникновением генетического материала от бактерии донора в бактерию реципиента с формированием дочернего генома, содержащим генов обеих исходных особей.

Включение фрагмента ДНК донора в рецепиента происходит кроссинговером

Три типа передачи -

Трансформация - процесс, при котором происходит передача фрагмента изолированной ДНК донора. Зависит от компетентности рецепиента и состояния донорской ДНК. Компетентность - способность поглощать ДНК. Она зависит от присутствия в клеточной мембране реципиента особых белков и формируется в определенные периоды роста бактерии. Донорская ДНК обязательно должна быть двухцепочечной и не очень большой по размеру. Донорская ДНК проникает через оболочку бактерий, причем одна из цепочек разрушается, другая встраивается в ДНК реципиента.
Трансдукция - осуществляется с помощью бактериофагов. Общая трансдукция и специфическая трансдукция.

Общая - происходит при участии вирулентных факторов. В процессе сборки фагов частиц в головку фага по ошибке может включаться не фаговая ДНК, а кусочек хромосомы бактерий. Такие фаги - дефектные фаги.

Специфическая - она осуществляется умеренными фагами. При вырезании, вырезание его строго осуществляется по границе.Встраиваются между определёнными генами и переносят их.

Коньюгация - передача генетического материала от бактерии донора рецепиенту, при их непосредственном контакте. Необходимым условием - наличие в клетке донора коньгативного плазмида. При коньюгации за счет пилей образуется коньюгационный мостик, по которому генетический материал передается от донора к пациенту.

Генодиагностика

Комплекс методов, позволяющих выявить геном микроорганизма или его фрагмента в исследуемом материале. Первым был предложен метод гибридизации НК. Основан на использовании принципа комплиментарности. Этот метод позволяет выявить в генетическом материале наличие маркерных фрагментов ДНК возбудителя с помощью молекулярных зондов. Молекулярные зонды представляют собой короткие цепочки ДНК, комплементарные маркерному участку. В состав зонда вводится метка - флюорозром, радиоактивный изотоп, фермент. Исследуемый материал подвергается специальнйо обработке, позволяющей разрушить микрооргнаизмы, высвободить ДНК и разделить ее на одноцепочечные фрагменты. После этого материал фиксируется. Затем выявляется активность метки. Этот метод не отличается высокой чувствительностью. Можно выявить возбудителя лишь при достаточно большом его количестве. 10 в 4 микроорганизмов. Он достаточно сложен технически и требует большого количества зондов. Широкого распространения в практике он не нашел. Был разработан новый метод - полимеразная цепная реакция - ПЦР.

Этот метод основан на способности ДНК и вирусных РНК к репликации, т.е. к саморепродукции. Суть у пациента - является многократное копирование - амплификация in vitro фрагмента ДНК, являющего маркерного для данного микроорганищма. Так как процесс проходит при достаточно высоких температурах 70-90, то метод стал возможен после выделения из термофильных бактерий термостабильной ДНК-полимеразы. Механизм амплификации таков, что копирование цепочек ДНК начинается не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках для создания которых используют так называемые праймеры. Праймеры представляют собой полинуклеотидные последовательности, комплиментарные концевым последовательностям копируемого фрагмента искомой ДНК, причем праймеры не только инициируют амплификацию, но и ограничивают. Сейчас существует несколько вариантов ПЦР характерны 3 этапа -

Денатурация ДНК(разделение на 1 цепочечные фрагменты)
Присоединение праймера.
Комплиментарное достраивание цепей ДНК до 2хцепочечных

Этот цикл длится 1,5-2 минуты. В результате количество молекул ДНК удваивает 20-40 раз. В результате 10 в 8 степени копий. После амплификации производят электрофорез и выделяются в виде полосок. Она проводится в специальном приборе, который называется амплификатор.

Достоинства ПЦР

Дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале, без выделения чистой культуры.
Очень высокая чувствительность. Теоретически можно обнаружить 1го.
Материал для исследования может быть сразу дизенфицировать после забора.
100% специфичность
Быстрота получения результатов. Полный анализ - 4-5 часов. Экспресс метод.

Достаточно широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются не культивируемые или трудно культивируемые организмы. Хламидии, микоплазмы, многие вирусы - гепатита, герпеса. Разработаны тест системы для определения сибирской язвы, туберкулеза.

Рестрикционный анализ - с помощью ферментов молекула ДНК разделяется по определенным последовательностям нуклеоидов и фрагменты анализируются поп составу. Таким образом можно найти уникальные участки.

Биотехнология и генная инженерия

Биотехнология это наука, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов использует эти биопроцессы, а также сами биологические объекты для промышленно производства продуктов необходимых для человека, для воспроизведения биоэффектов, не проявляющихся в неестественных условиях. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, а также клетки, животных и растений. Клетки очень быстро воспроизводятся, что позволяет за короткое время нарастить биомассу продуцента. В настоящее время биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, экономичнее и технологически доступнее чем другие виды сырья.

Биотехнология использует сами клетки как источник целевого продукта а также крупные молекулы, синтезируемые клеткой, ферменты токсины, антитела и первичные и вторичные метаболиты - аминокислоты, витамины,гормоны. Технология получения продуктов микробного и клеточного синтеза сводится к нескольким типовым стадиям - выбор или создание продуктивного штаба. Подбор оптимальной питательной среды, культивирование. Выделение целевого продукта, его очистка, стандартизация, придание лекарственной формы. Генетическая инженерия сводится к созданию необходимый для человека целевой продукции. Полученный целевой ген сшивают с вектором, а вектором может быть плазмиды и встраивают его в клетку реципиента. Реципиент - бактерия - кишечная палочка, дрожжи. Синтезируемые рекомбинантами целевые продукты, выделяют очищают и используют в практике.

Первыми, были созданы инсулин и человеческий интерферон. Эритропоэтин, гормон роста, монокланальные антитела. Вакцина против гепатита Б.

Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике - для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (антигенов) разрушенных микробных клеток, особенно в случае неоднократного применения. При получении препаратов фагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактериальную культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в логарифмической фазе размножения, заражают маточной взвесью фага.

Лизированную фагом культуру (обычно на следующий день) фильтруют через бактериальные фильтры и к фильтрату, содержащему фаг, в качестве консерванта добавляют раствор хинозола.
Готовый препарат фага представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета. Для более длительного хранения некоторые фаги выпускаются в сухом виде (в таблетках). При лечении и профилактике кишечных инфекций фаги применяют одновременно с раствором гидрокарбоната натрия, так как кислое содержимое желудка разрушает фаг. Сохраняется фаг в организме недолго (5-7 дней), поэтому рекомендуется применять повторно.

В Советском Союзе выпускались следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.

Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

С.М. ЗАХАРЕНКО, к.м.н., доцент, Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Бактериофаги – уникальные микроорганизмы, на основе которых создана особая по своим свойствам и характеристикам группа лечебно-профилактических препаратов. Лежащие в основе их действия природные физиологические механизмы взаимодействия фагов и бактерий позволяют прогнозировать бесконечное разнообразие как самих бактериофагов, так и возможных способов их применения. По мере расширения коллекций бактериофагов, несомненно, будут появляться новые целевые патогены, будет расширяться спектр заболеваний, при которых фаги могут применяться как в режиме монотерапии, так и в составе комплексных схем лечения.

Так, использование поливалентного пиобактериофага Секстафаг при лечении инфицированного панкреонекроза (Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера) позволило быстрее восстанавливать у больных основные параметры гомеостаза и функции органов и систем. Также значительно снизилось количество послеоперационных осложнений и летальных исходов: в группе больных, получавших стандартную терапию, летальность составила 100%, в то время как в труппе, получавшей БФ, - 16,6% .

Вследствие безвредности и ареактогенности препаратов БФ возможно их применение в педиатрической практике, в т. ч. и у новорожденных детей. Интересен опыт Нижегородской детской областной клинической больницы, где в период осложнения эпидемиологической ситуации наряду с обычными противоэпидемическими мероприятиями были использованы и БФ - Интести-бактериофаг и БФ Pseucfomonas aeruginosa. Снижение заболеваемости внутибольничной инфекцией синегнойной этиологии в 11 раз показало высокую эффективность применения БФ . Препараты БФ могут назначаться как для лечения дисбактериоза и расстройств пищеварительной системы, так и для предотвращения колонизации слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта условно-патогенными бактериями. Поликомпонентные препараты БФ идеальны для немедленного купирования первых признаков расстройства желудочно-кишечного тракта.

На сегодняшний день на предприятии намечен целый ряд приоритетных направлений разработки и производства лечебно-профилактических бактериофагов, которые коррелируют с вновь зарождающимися общемировыми тенденциями. Создаются и внедряются новые препараты: разработаны БФ против серраций и энтеробактерий, ведутся работы по созданию фагового препарата против Helicobacter pylori.

Лишь один производитель этих препаратов – НПО «Микроген», по докладу замглавы управления науки и инновационного развития Аллы Лобастовой, выпускает более 2 млн упаковок ежегодно . К сожалению, представления многих врачей о бактериофагах далеки от объективности. Не многие знают, что бактериофаги, активные в отношении одного и того же возбудителя, могут относиться к разным семействам, обладать различным жизненным циклом и т. п. Так, например, бактериофаги P. aeruginosa относятся к семействам Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, имеют литический жизненный цикл или умеренный. Разные штаммы одного и того же патогена могут обладать различной чувствительностью к бактериофагам. Большинство специалистов знают (слышали, кто-то применял) о существовании жидкой и таблетированной лекарственной формы лечебно-профилактических препаратов бактериофагов. Однако их спектр существенно шире, что может быть отнесено к безусловным преимуществам, особенно в сочетании с многообразием путей введения (прием внутрь, введение в клизмах, аппликации, орошение ран и слизистых оболочек, введение в раневые полости и т. п.) . К очевидным преимуществам бактериофагов традиционно относят специфическое воздействие на достаточно ограниченную популяцию бактерий, ограниченное во времени существование (пока не исчезнет целевая популяция микроорганизмов), отсутствие таких побочных эффектов, как токсические и аллергические реакции, дисбиотические реакции и др. Эти препараты могут применяться в самых разных возрастных группах и при беременности . Сами бактериофаги не являются значимыми аллергенами. Случаи непереносимости препаратов бактериофагов связаны в своем большинстве с реакцией на компоненты питательной среды. Все крупные производители этой группы препаратов стремятся к максимальному качеству используемых компонентов, что уменьшает вероятность таких реакций. В условиях роста антибиотикорезистентности некоторые авторы предлагают рассматривать бактериофаги как наилучшую альтернативу антибиотикам. Лечебно-профилактические препараты бактериофагов представляют собой коктейль из специально подобранных комбинаций (комплекс поликлональных высоковирулентных бактериальных вирусов, специально подобранных против наиболее часто встречающихся групп возбудителей бактериальных инфекций) на основе коллекций фагов производителя . Филиалы ФГУП «НПО «Микроген» в Уфе, Перми и Нижнем Новгороде – современные центры производства таких препаратов. Возможность создания адаптированных к конкретным патогенным микроорганизмам лечебно-профилактических препаратов бактериофагов – еще одно важнейшее преимущество этой группы препаратов. Рост устойчивости бактерий к антимикробным препаратам и часто встречающаяся полиэтиологичность современных инфекционных заболеваний требуют проведения комбинированной антибиотикотерапии (двух, трех, а иногда и более антимикробных препаратов). Для выбора эффективной схемы терапии антибиотиками, помимо собственно чувствительности бактерии к препарату, необходимо учесть достаточно большое число факторов. Фаготерапия в этом отношении также имеет определенные преимущества. С одной стороны, применение комбинации бактериофагов не сопровождается их взаимодействием между собой и не ведет к изменению схем их применения. В рамках имеющегося набора лечебных бактериофагов существуют ряд хорошо себя зарекомендовавших комбинаций – бактериофаг колипротейный, пиобактериофаг поливалентный, интести-бактериофаг. С другой стороны, бактерии не имеют общих механизмов устойчивости к антибиотикам и фагам, следовательно, могут они применяться как при устойчивости патогена к одному из препаратов, так и в комбинации «антибиотик + бактериофаг». Особенно эффективна такая комбинация для разрушения микробных биопленок. В эксперименте убедительно показано, что комбинированное применение антагонистов железа и бактериофага способно нарушать формирование биопленок Klebsiella pneumoniae . При этом отмечается как достоверное уменьшение численности микробной популяции, так и уменьшение числа «молодых» клеток. Еще одной важной особенностью действия бактериофагов является такой феномен, как индукция апоптоза. Некоторые штаммы E. coli имеют гены, вызывающие гибель клетки после внедрения в нее бактериофага Т4 . Так, в ответ на экспрессию поздних генов фага Т4 ген lit (кодирует протеазу, разрушающую необходимый для синтеза белков фактор элонгации EF-Tu ) блокирует синтез всех клеточных белков. Ген prrC кодирует нуклеазу, расщепляющую лизиновую тРНК. Нуклеаза активируется продуктом гена stp фага Т4. У инфицированных фагом Т4 клеток гены rex (относятся к геному фага и экспрессируются в лизогенных клетках) вызывают формирование ионных каналов, ведущих к потере клетками жизненно важных ионов и впоследствии к гибели. Предотвратить гибель клетки может сам фаг Т4, закрывая каналы своими белками, продуктами генов rII . В случае формирования устойчивости бактерий к антибиотику приходится искать новые варианты модификации активной молекулы или принципиально новые вещества. К сожалению, за последние годы темпы внедрения новых антибиотиков существенно замедлились. Ситуация с бактериофагами принципиально иная. Коллекции крупных производителей насчитывают десятки готовых штаммов бактериофагов и постоянно пополняются новыми активными фагами . Благодаря постоянно проводимому мониторингу чувствительности выделяемых патогенов к бактериофагам производители корректируют поставляемые в регионы фаговые композиции . Благодаря адаптированным бактериофагам удается ликвидировать вспышки внутригоспитальных инфекций, вызываемых резистентными к антибиотикам штаммами .

При пероральном приеме бактериофаги быстро достигают очагов локализации инфекции: при пероральном приеме больными с гнойно-воспалительными заболеваниями уже через час фаги попадают в кровь, через 1–1,5 ч выявляются из бронхолегочного экссудата и с поверхности ожоговых ран, через 2 ч – из мочи, а также из ликвора больных с черепно-мозговыми травмами .

Таким образом, бактериофаги – уникальные микроорганизмы, на основе которых создана особая по своим свойствам и характеристикам группа лечебно-профилактических препаратов. Лежащие в основе их действия природные физиологические механизмы взаимодействия фагов и бактерий позволяют прогнозировать бесконечное разнообразие как самих бактериофагов, так и возможных способов их применения. По мере расширения коллекций бактериофагов, несомненно, будут появляться новые целевые патогены, будет расширяться спектр заболеваний, при которых фаги могут применяться как в режиме монотерапии, так и в составе комплексных схем лечения. Современный взгляд на дальнейшую судьбу фаготерапии должен быть основан как на высокой специфичности их действия, так и на необходимости строго соблюдения всех правил фаготерапии. Противопоставление бактериофагов любым средствам этиотропной терапии является ошибочным.

Действие бактериофага на микробную культуру в жидкой среде и на плотной среде

Метод Отто (стекающая капля)

Опыт на жидкой питательной среде

Фаготипирование бактерий